在過去幾年中，第二代測序（NGS）的巨大進步使DNA測序的成本大大降低，盡管如此，人類全基因組測序和生物信息的解讀成本依舊很大。第二代測序對全基因組測序和整個外顯子測序非常有效，這就需要基于靶向測序方法，也就是說需要在測序前的樣本制備過程中，應用目標序列捕獲技術，雜交和多重PCR是賊常用的方法。

Yan Gao等發(fā)表在《自然》雜志上的研究非常更多的介紹了單分子靶向測序（SMTS），其原理是將靶向捕獲和測序結合在一個步驟中，使用高分辨率顯微鏡，在單分子水平上檢測標記在核苷酸上的熒光探針。將目的基因的特異性引物附著在流動池的表面上，通過與流式細胞中的引物雜交進行測序，而不需要利用PCR富集，與第二代利用靶向測序方法相比，單分子靶向測序簡化了樣品制備的復雜過程，避免了PCR擴增引起的偏差或誤差。單分子測序技術提供了一個非常適合癌癥基因突變檢測、傳染病檢測、遺傳病癥篩查和產(chǎn)前診斷的新平臺。
 

熒光染料標記核苷酸的選擇對于單分子檢測也是至關重要的，選擇ATTO 647N染料標記核苷酸，對EGFR，KRAS和BRAF基因進行測序，并合成了野生型序列和含有突變與短缺失的兩套用于測序的靶向DNA模板，并且在3'末端含有Cy3熒光染料。用532nm綠色激光激發(fā)標記Cy3熒光染料，并收集圖像以定位靶DNA模板的位置。然后，把利用ATTO647N和DNA聚合酶修飾過的可逆終止子加入到流動池中，重復測序循環(huán)，直到達到所需的讀取長度。在四次運行中，每個基座的平均替代誤差率為0.52％。

單分子靶向測序相對于一代、二代測序優(yōu)勢如下：
 

1、樣品制備程序簡單快捷；

     2、單分子靶向測序技術成本低；

     3、周轉時間和樣品處理錯誤的風險低；  

     4、可直接對原始樣品分子序列，而不是PCR擴增產(chǎn)物。

賊近，牛津Nanopore公司發(fā)布了他們的測試版本的測序儀，其可能達到超過100,000個堿基對的序列長度。與其他單分子測序技術相比，單分子靶向測序在一個流動池中直接捕獲和測序目的基因是有優(yōu)勢的。