【佳學(xué)基因檢測(cè)】分子診斷與基因檢測(cè)中的數(shù)字PCR技術(shù)

數(shù)字PCR是PCR技術(shù)發(fā)展過程中的第三代聚合物酶鏈擴(kuò)增技術(shù)。數(shù)字?jǐn)U增技術(shù)常寫為DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR。雖然其基本原理仍然是1993年化學(xué)獎(jiǎng)得主美國(guó)生物化學(xué)家穆利斯發(fā)現(xiàn)的，但是佳學(xué)基因通過終點(diǎn)檢測(cè)計(jì)算目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，無需采用內(nèi)參和標(biāo)準(zhǔn)曲線即可進(jìn)行正確的先進(jìn)定量檢測(cè)。

數(shù)字PCR采用終點(diǎn)檢測(cè)，不依賴于Ct值（循環(huán)閾值），所以數(shù)字PCR反應(yīng)受擴(kuò)增效率的影響降低，對(duì)PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力提高，具有很高的正確度和重現(xiàn)性。

由于具備高靈敏度、高正確度的特點(diǎn)，基因檢測(cè)不易被PCR反應(yīng)抑制劑干擾，無需標(biāo)準(zhǔn)品可實(shí)現(xiàn)真正意義的先進(jìn)定量，而成為研究和應(yīng)用熱點(diǎn)。

根據(jù)反應(yīng)單元的不同形式，主要可分為微流體式、芯片式和微滴式三大類系統(tǒng)。

1)微流體數(shù)字PCR，Microfluidic digital PCR，mdPCR。

基于微流控技術(shù)，對(duì)分子診斷DNA模板進(jìn)行分液，微流控技術(shù)能實(shí)現(xiàn)樣品納升級(jí)或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再與PCR反應(yīng)體系結(jié)合，mdPCR已逐漸被其他方式取代。

2)微滴數(shù)字PCR，Droplet-based digital PCR，ddPCR。

利用油包水微滴生成技術(shù)對(duì)分子診斷樣品進(jìn)行微滴化處理，將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個(gè)納升級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。

以伯樂的ddPCR為例，主要包括三個(gè)步驟：

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    第一，準(zhǔn)備樣本和生成微滴，如下圖，8x3的微孔板，一排加樣本，一排加油滴，通過微滴生成器每個(gè)樣本生成20000個(gè)微滴。

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    第二，進(jìn)行“油包水”PCR，把微孔板放入PCR擴(kuò)增儀，對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行40個(gè)熱循環(huán)的PCR反應(yīng)。

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    第三，讀取微滴結(jié)果，把微孔板放入讀取儀，通過流式細(xì)胞技術(shù)獲取每個(gè)微滴PCR終點(diǎn)結(jié)果的熒光信號(hào)，并用泊松分布原理糾正結(jié)果。

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Bio-rad去年上市的Bio-Rad QX ONE數(shù)字PCR系統(tǒng)整合了微滴生成、熱循環(huán)反應(yīng)及微滴讀取等步驟，賊大程度減少人工操作。

配備四個(gè)獨(dú)立的熒光檢測(cè)通道，結(jié)合ddPCR特有的高階多重PCR技術(shù)，可以在單反應(yīng)孔中實(shí)現(xiàn)8重拷貝數(shù)變異(CNV)檢測(cè)、5重突變檢測(cè)或4重基因表達(dá)檢測(cè)。

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3)芯片數(shù)字PCR，Chip-based digital PCR，cdPCR。

利用集成流體通路技術(shù)在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，通過不同的控制閥門控制溶液在其中的流動(dòng)，將樣本液體分成大小一致的納升級(jí)于反應(yīng)孔種進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)基因檢測(cè)對(duì)特定基因序列的先進(jìn)定量。

以法國(guó)Stilla technologies 公司的cdPCR技術(shù)為例，主要包括以下步驟：

    第一，加樣和生成微滴：將樣本和PCR反應(yīng)液加入微流控芯片，放入儀器中，儀器可通過物理方法生成單層平鋪的20000~30000個(gè)微滴陣列。

    第二，對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行PCR擴(kuò)增：在Naica Geode微滴生成擴(kuò)增系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

    第三，讀取和分析結(jié)果：將芯片置于Prism微滴讀取分析系統(tǒng)上進(jìn)行熒光信號(hào)采集，計(jì)數(shù)陰陽性微滴，通過泊松分布計(jì)算獲得靶標(biāo)基因先進(jìn)拷貝數(shù)濃度。

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總結(jié)一下，將分子診斷基因檢測(cè)樣本和PCR反應(yīng)液加入微流控芯片，放入儀器中，通過物理方法生成單層平鋪的微滴陣列，隨后對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行六通道熒光信號(hào)采集，計(jì)數(shù)陰陽性微滴，通過泊松分布計(jì)算獲得靶標(biāo)基因先進(jìn)拷貝數(shù)濃度。

第三代PCR主要缺點(diǎn)：

儀器和試劑昂貴。

采用這種分子診斷技術(shù)模板質(zhì)量要求較高，模板量超過微體系量將導(dǎo)致無法定量，過少則定量基因檢測(cè)正確度降低。

當(dāng)存在非特異性擴(kuò)增時(shí)也會(huì)產(chǎn)生假陽性。

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