【佳學(xué)基因檢測】MLPA基因檢測技術(shù)、項目及應(yīng)用
基因序列的變化也就是基因突變是人類疾病的賊終根源。通過基因檢測,發(fā)現(xiàn)基因序列的突變,結(jié)合基因解碼技術(shù),不僅可以知道疾病發(fā)生的原因、疾病根源的來源。還可以理解疾病的發(fā)病機理,為藥物研制提供方向。同時,也可以知道該病的遺傳方式。但是,任何一種方法都無法有效地檢測所有的基因突變。采用分步實施,逐一排除的方法,可以將檢出率,陽性率提高到95%。而MLPA方法可以鑒定有效或部分基因缺失和重復(fù),如果MLPA檢測結(jié)果為陰性時,采用HPLC檢測cDNA序列,檢測剪接突變、小缺失/重復(fù)。也可以采用測序的方法分析NF1基因的一個區(qū)域。
神經(jīng)纖維瘤病1(NF1)是一種常染色體顯性疾病,由NF1基因突變引起,臨床表現(xiàn)廣泛,該病的臨床表現(xiàn)包括咖啡斑、神經(jīng)纖維瘤、腹股溝雀斑、虹膜錯構(gòu)瘤、腫瘤或骨骼異常等。其中超過50%的患者存在學(xué)習(xí)。不同的患者表現(xiàn)出來的臨床表征互不相同。不僅在家庭之間,而且在同一個家庭內(nèi),甚至是同一個患者的不同時間也會有不同的表現(xiàn)。從遺傳學(xué)的基因的發(fā)生根源上來講,該病也是異源性的,NF1基因的致病基因突變包括停止突變、氨基酸替代、插入、缺失(部分或全部)和染色體重排;另外,50%的患者有新發(fā)突變。依據(jù)NIH規(guī)定的臨床標(biāo)準(zhǔn)進行診斷,在有家族病史的成人或兒童中具有特異性和敏感性,但無NF1家族史的兒童中,只有50%患者可以在1歲前進行診斷;因此,NF1是與咖啡斑相關(guān)的賊常見的疾病,盡管在沒有NF1家族史的兒童身上出現(xiàn)這些斑點,但這很可能是神經(jīng)纖維瘤病的征兆。因此,對疑似NF1的患者進行分子診斷已經(jīng)進行了很長時間。
新一代測序技術(shù)被用于診斷這種疾病和其他疾病,以提供更便宜、更快的突變識別。檢測NF1上的突變是一個挑戰(zhàn),佳學(xué)基因采用了互相補充的方法來檢測和發(fā)現(xiàn)疑似患者存的微小變化,如單堿基替換、插入和缺失、外顯子缺失或復(fù)制、微缺失或有效基因缺失。
熒光原位雜交(FISH)、染色體微陣列分析(CMA)和細(xì)胞遺傳學(xué)分析(核型)可用于檢測整體和大規(guī)?;蛉笔А⒅貜?fù)或重排等總突變,但這些方法分別只能檢測NF1上所有突變的2-5%、5%和1%以下。其他方法也可以檢測到其中的一些突變。單堿基替換、插入和缺失等微小變化可通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)和一下代測序(Next-generation Sequencement,NGS)來檢測。下一代基因測序可以測定全基因組DNA,靶向特定序列或外顯子測序三種模式;變性高效液相色譜(DHPLC)也可用于檢測小缺失和重復(fù);MLPA(多重結(jié)扎依賴探針擴增)檢測到的缺失和重復(fù)是在細(xì)胞遺傳學(xué)分析可以分析突變以及HPLC鑒定的缺失和重復(fù)之間,即MLPA有助于檢測完整或單外顯子缺失或重復(fù)。
正如前面所解釋的,任何一種方法都無法有效地檢測所有NF1基因突變,但有報告稱,多步突變檢測的策略的靈敏度高達95%。佳學(xué)基因設(shè)計的方案中,第一步是使用MLPA鑒定有效或部分NF1基因缺失和重復(fù),如果MLPA檢測結(jié)果為陰性時,采用HPLC檢測cDNA序列,檢測剪接突變、小缺失/重復(fù)。也可以采用測序的方法分析NF1基因的一個區(qū)域,由于mRNA序列的內(nèi)在特征,GC含量高,使得cDNA的擴增困難。第三種方法是單倍型分析來確定哪些突變具有潛在致病性,因為突變也可能是非致病性變體;所有在每個步驟中發(fā)現(xiàn)的突變都經(jīng)過Sanger測序確認(rèn)。
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