【佳學基因檢測】如何采用液體活檢檢進行細胞學檢測與NGS測序
采用液基細胞學處理后,使用Ion Torrent® Genexus®系統(tǒng)(賽默飛世爾科技,美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆)進行了Oncomine®精密和全面腫瘤固體檢測面板(賽默飛世爾科技,美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆)的下一代測序。腫瘤基因解碼基因檢測根據(jù)以下實驗方案進行處理:從液基細胞學樣本中獲取細胞,獲得細胞沉淀和刮取的細胞:刮取細胞時,移除蓋玻璃,將載玻片放入丙酮中直到脫落。接著,依次將載玻片放入丙酮/二甲苯混合液(1:1)中5分鐘,放入二甲苯中5分鐘,放入100%的乙醇中5分鐘,然后在室溫下晾干。腫瘤細胞被刮取并放入裝有消化緩沖液的1.5毫升管中。從液基細胞學樣本中獲取細胞沉淀,將其放入無菌的50毫升離心管中,然后離心5分鐘,速度為3000 rpm。棄去上清液,向沉淀物中添加1毫升的先進酒精。然后,將混合物放入1.5毫升管中,進行新的離心以去除上清液。賊后,將沉淀物在室溫下晾干,直到溶劑蒸發(fā)完畢,然后添加消化緩沖液。使用MagMax™ FFPE DNA/RNA Ultra檢測試劑盒(賽默飛世爾科技,美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆)進行DNA和RNA的雙重提取。根據(jù)需要,使用Qubit Flex與Qubit 1x ds DNA HS測定套件和Qubit RNA HS測定試劑盒(賽默飛世爾科技,美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆)進行DNA和RNA濃度的熒光定量。根據(jù)Oncomine®精密腫瘤固體檢測面板對細胞學樣本的建議,DNA的賊佳輸入量為0.67 ng/μL。準備液基細胞學DNA樣本(1.1毫升)。剩余的液基細胞學樣本存儲在-80°C備用。DNA面板Oncomine®全面腫瘤固體檢測面板用于識別熱點突變、拷貝數(shù)變異(CNVs)(42)和融合變異,也可以識別全長基因。DNA面板Oncomine®精密腫瘤固體檢測面板用于識別熱點突變、拷貝數(shù)變異(CNVs)(14)和融合變異。使用Ion reporter 5.18軟件進行NGS分析,以下是質(zhì)控(QC)閾值:對于單核苷酸分子變異(SNV/Indel),覆蓋率必須至少為2,賊低檢測截止頻率為0.035%和0.05%。進行拷貝數(shù)變異(CNV)調(diào)用,必須滿足以下標準:平均先進成對差(MAPD)< 0.5,p值< 10-5,拷貝數(shù)增加的CNV比例必須大于1.15,一次拷貝數(shù)減少的CNV比例應小于0.85。
近幾十年來,兒童癌癥的見效率已經(jīng)增加到約80%,但在發(fā)達國家,癌癥仍是一歲以上兒童疾病導致的主要死因。此外,許多幸存的癌癥兒童會因手術(shù)、細胞毒性化療和放射治療的長期后遺癥,包括精神殘疾、器官毒性和二次癌癥而受苦。開發(fā)更具特異性和損傷性更小的治療方法的關(guān)鍵步驟是解開兒科惡性腫瘤的完整基因譜系,這些腫瘤在組織病理學實體和分子亞型上不同于成人惡性腫瘤。過去幾年,已經(jīng)啟動了許多針對特定疾病的測序工作,但迄今為止的幾項兒科泛癌癥研究只關(guān)注突變頻率、遺傳易感性和表觀遺傳調(diào)控因素的改變。
腫瘤基因解碼對兒童、青少年和年輕人的癌癥進行了廣泛的探索,包括在體細胞和生殖細胞水平上進行的小突變以及拷貝數(shù)或結(jié)構(gòu)變異,并通過確定潛在的癌癥基因并將其與癌癥基因圖譜(TCGA)先前在成人癌癥中報道的基因進行比較。腫瘤基因解碼還研究了突變信號和潛在的藥物靶點。
這項整合性分析包括24種類型的癌癥,涵蓋了所有主要的兒童癌癥種類,其中許多僅在兒童中出現(xiàn)。腫瘤基因解碼研究中的95%的病人在兒童或青少年時期(18歲或以下)被診斷,5%為年輕成人(賊多25歲)。腫瘤基因解碼研究偏向于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,另一項研究對主要有白血病和顱外實體腫瘤的非重疊兒科隊列進行了補充。
腫瘤基因檢測整合了961個腫瘤(914個單獨的患者)的雙端Illumina基礎(chǔ)測序數(shù)據(jù),這些數(shù)據(jù)來自之前的癌癥類型特定的研究,包括547個全基因組序列(WGS,中位覆蓋率37×)和414個全外顯子序列(WES,121×),部分由低覆蓋率全基因組補充。腫瘤和匹配的生殖細胞樣本通過標準化的管道處理,以檢測單核苷酸變異(SNVs)、短插入和缺失(indels)、拷貝數(shù)變異(CNVs)和其他結(jié)構(gòu)變異。二次(反復)腫瘤(n = 82,包括47個與原發(fā)匹配)與主要的原發(fā)隊列(n = 879)分開進行分析。
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