【佳學(xué)基因檢測(cè)】極微量(單細(xì)胞擴(kuò)增)基因檢測(cè)程序及步驟
試劑來(lái)源:
佳學(xué)基因致力于從多種來(lái)源的DNA樣品中正確測(cè)定人體的基因序列變化,并對(duì)這些變化的生命密碼進(jìn)行解讀和分析。是先進(jìn)基因信息檢測(cè)及解碼技術(shù)的供應(yīng)者,提供各種樣本純化和分析的方法和產(chǎn)品。先進(jìn)的、高質(zhì)量的產(chǎn)品和服務(wù)確保了從樣本獲得分析結(jié)果。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
對(duì)單個(gè)細(xì)胞或有限的樣本進(jìn)行高度均一的全基因組擴(kuò)增(WGA)
采用多重置換擴(kuò)增技術(shù)對(duì)基因組位點(diǎn)進(jìn)行無(wú)偏差的擴(kuò)增
適用于二代測(cè)序等新技術(shù)應(yīng)用
產(chǎn)量穩(wěn)定,可達(dá)40 µg(產(chǎn)物平均長(zhǎng)度大于>10 kb)
可用于癌癥、干細(xì)胞或宏觀基因組學(xué)(metagenomics)研究
很多研究人員使用二代測(cè)序儀器對(duì)生物樣本的DNA序列進(jìn)行分析和基因分型,但經(jīng)常受限于有限的樣本量。佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)可均一的擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞(1至1000個(gè)細(xì)菌或腫瘤細(xì)胞)或純化的基因組DNA,能夠覆蓋基因組所有位點(diǎn)。另有專用于干血或新鮮或冷凍的組織樣本的實(shí)驗(yàn)方案。所有緩沖液和試劑生產(chǎn)都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格控制的流程,避免污染DNA,確保每次實(shí)驗(yàn)獲得高效的結(jié)果。該產(chǎn)品采用多重置換擴(kuò)增(MDA)技術(shù),對(duì)所有基因組位點(diǎn)進(jìn)行無(wú)偏差的擴(kuò)增。與基于PCR的全基因組擴(kuò)增技術(shù)相比,該技術(shù)具有更好的擴(kuò)增高保真度,避免出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性信號(hào)。
Performance
覆蓋基因組所有位點(diǎn),十分適用于二代測(cè)序和其他下游應(yīng)用
佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增的DNA平均長(zhǎng)度大于10 kb,并且覆蓋所有基因組位點(diǎn)。該產(chǎn)品已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證,適用于二代測(cè)序、基于芯片技術(shù)的比較基因組雜交(aCGH)和real-time PCR應(yīng)用等多種下游分析。使用該產(chǎn)品無(wú)需單獨(dú)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,減少了手動(dòng)操作,獲得的產(chǎn)物長(zhǎng)度PCR方法更長(zhǎng)(參見(jiàn)"Next-generation sequencing using REPLI-g amplified DNA requires less hands-on time and generates more sequence information than PCR-based methods")。用擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行二代測(cè)序,獲得高品質(zhì)結(jié)果。這表明該試劑盒的位點(diǎn)覆蓋率大,錯(cuò)配率低,其擴(kuò)增的DNA(甚至從單一細(xì)菌細(xì)胞中擴(kuò)增的DNA)能夠與純化獲得的基因組DNA相媲美(參見(jiàn)"Comparable NGS results")。另有研究對(duì)人類常染色體和X染色體上的多個(gè)標(biāo)記物進(jìn)行了分析,三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)均顯示:基因組的所有位點(diǎn)被成功擴(kuò)增,沒(méi)有遺漏任何一個(gè)位點(diǎn)(參見(jiàn)"Complete genome coverage")。
佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)的表現(xiàn)優(yōu)于其他供應(yīng)商的試劑盒
其他供應(yīng)商的試劑盒基于PCR技術(shù)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增,獲得的產(chǎn)物片段較短,帶有PCR引物序列,可能影響下游應(yīng)用?;赑CR的全基因組擴(kuò)增容易出現(xiàn)錯(cuò)誤,會(huì)導(dǎo)致堿基對(duì)突變、STR的減少或增多,使用低保真Taq DNA聚合酶會(huì)導(dǎo)致位點(diǎn)缺失。相反,REPLI-g Single Cell Kit能夠進(jìn)行高度均一的全基因組擴(kuò)增,位點(diǎn)偏差小。對(duì)四個(gè)試劑盒進(jìn)行了檢測(cè),其中兩個(gè)利用多重置換擴(kuò)增技術(shù)(包括REPLI-g Single Cell Kit),另外兩個(gè)利用PCR技術(shù)。采用單一細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)方案對(duì)所有試劑盒進(jìn)行序列位點(diǎn)檢測(cè)。除REPLI-g Single Cell Kit外的其他供應(yīng)商的試劑盒都出現(xiàn)了位點(diǎn)的遺漏(參見(jiàn)"Unbiased DNA amplification from a single cell")。
Principle
佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)含有REPLI-g sc Polymerase,這是一種優(yōu)化的新型高保真Phi 29聚合酶。該試劑盒采用多重置換擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增復(fù)雜的基因組DNA,溫和的堿孵育能夠避免DNA片段化,促進(jìn)對(duì)所有位點(diǎn)的無(wú)偏差擴(kuò)增。該試劑盒十分適用于分離的腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞等單一細(xì)胞,能夠擴(kuò)增獲得高產(chǎn)量DNA(參見(jiàn)表1)。此外,該試劑盒還配有專用于鮮血或干血、新鮮或冷凍組織的實(shí)驗(yàn)方案,可用于多種研究樣本。常規(guī)DNA產(chǎn)量可達(dá)40 µg,對(duì)模板的起始量要求低,因此進(jìn)行后續(xù)遺傳分析時(shí)無(wú)需檢測(cè)DNA濃度。REPLI-g Single Cell Kit的擴(kuò)增產(chǎn)物平均長(zhǎng)度超過(guò)10 kb,且覆蓋所有位點(diǎn),適合于多種應(yīng)用,包括二代測(cè)序、基于芯片技術(shù)的比較基因組雜交、焦磷酸測(cè)序和real-time PCR分析(參見(jiàn)表2)。
擴(kuò)增原理
佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)采用等溫基因組擴(kuò)增技術(shù),即多重置換擴(kuò)增(MDA)。六聚體與變性DNA隨機(jī)結(jié)合,然后在等溫條件下,在優(yōu)化的Phi 29聚合酶作用下,發(fā)生鏈置換合成反應(yīng)。每個(gè)置換后的單鏈作為模板,與引物結(jié)合,可擴(kuò)增獲得高產(chǎn)量DNA(參見(jiàn)"Multiple Displacement Amplification (MDA) technology")。Phi 29聚合酶為噬菌體衍生酶,具有3'→5'引物外切酶活性(校正活性),其保真性是Taq DNA聚合酶的1000倍。Phi 29聚合酶在優(yōu)化的REPLI-g Single Cell緩沖液體系中,能夠輕松的打開(kāi)發(fā)卡結(jié)構(gòu)等二級(jí)結(jié)構(gòu),因此可促進(jìn)擴(kuò)增時(shí)聚合酶正常工作??蓴U(kuò)增獲得長(zhǎng)達(dá)100 kb的DNA片段(參見(jiàn)"Unbiased amplification with Phi 29 polymerase")。
細(xì)胞裂解和DNA的堿變性
基因組DNA在用于酶促擴(kuò)增反應(yīng)前必須經(jīng)過(guò)變性,而這一變性過(guò)程通常使用高溫或高pH值(強(qiáng)堿)孵育。佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)采用溫和的堿孵育,在細(xì)胞裂解、DNA變性的同時(shí),確保DNA片段化程度小,不產(chǎn)生堿基突變。因此擴(kuò)增獲得的DNA完整度高,產(chǎn)物長(zhǎng)度長(zhǎng),覆蓋位點(diǎn)多(參見(jiàn)"Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation")。
高效去除可檢測(cè)到的DNA污染
佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)中的所有組分都經(jīng)過(guò)了獨(dú)特的去污染流程,避免擴(kuò)增產(chǎn)物被污染。在標(biāo)準(zhǔn)化流程中,對(duì)緩沖液和試劑進(jìn)行紫外線照射,確保其不會(huì)污染DNA(參見(jiàn)"Innovative decontamination procedure")。紫外線照射后,對(duì)試劑盒的所有組分進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制,確保其性能。
Procedure
簡(jiǎn)單的單管操作
佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)t可對(duì)單一細(xì)胞或有限的樣本進(jìn)行簡(jiǎn)便、高效、正確的全基因組擴(kuò)增。反應(yīng)體系構(gòu)建十分便利、高效,僅需15分鐘左右的手動(dòng)操作(參見(jiàn)"REPLI-g Single Cell Kit procedure")。專用的緩沖液和試劑可對(duì)單一細(xì)胞、有限的組織材料、或純化的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)量高、位點(diǎn)覆蓋率大(參見(jiàn)表3)。REPLI-g技術(shù)擴(kuò)增獲得的DNA可在–20°C長(zhǎng)期儲(chǔ)存(參見(jiàn)"Consistent long-term stability")。
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