【佳學(xué)基因檢測(cè)】二代測(cè)序（NGS）技術(shù)應(yīng)用于臨床腫瘤正確醫(yī)學(xué)診斷的共識(shí)

先進(jìn)版（試行）2016.04.23
 

腫瘤基因檢測(cè)導(dǎo)讀：

佳學(xué)基因是一個(gè)充分挖掘基因信息在各個(gè)領(lǐng)域的價(jià)值的專業(yè)機(jī)構(gòu)。對(duì)于腫瘤與癌癥來(lái)說(shuō)，基因解碼充分利用基因信息指導(dǎo)腫瘤遺傳性分析與明確、腫瘤與癌癥尤其是肺癌的早期診斷與治療。基因的解碼信息還被應(yīng)用于腫瘤靶向藥物、個(gè)性化藥物的開(kāi)發(fā)與臨床應(yīng)用。正確的利用基因信息首先需要全面、正確的獲得基因序列。而二代測(cè)序是獲取肝癌、腸癌、乳腺癌患者腫瘤治療信息的先進(jìn)步，通過(guò)基因解碼而不是基因檢測(cè)是建立基因序列與腫瘤癌變、轉(zhuǎn)移和治療關(guān)系的另一個(gè)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。

 

中國(guó)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因分析聯(lián)盟（CAGC）
中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（CSCO）

共識(shí)摘要：

本專家組代表中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（CSCO）及中國(guó)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因分析聯(lián)盟（CAGC）提供二代測(cè)序（NGS）技術(shù)應(yīng)用于臨床腫瘤驅(qū)動(dòng)基因分析的相關(guān)指導(dǎo)性建議。專家組由實(shí)驗(yàn)室癌癥遺傳學(xué)家、臨床腫瘤學(xué)家、生物信息學(xué)專家、病理學(xué)家和其他人員組成。建議內(nèi)容在多次討論修改后定為初步共識(shí)，主要包括NGS技術(shù)應(yīng)用需求及相關(guān)臨床樣本收集處理、NGS檢測(cè)內(nèi)容、測(cè)序流程、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報(bào)告、技術(shù)質(zhì)量認(rèn)證和驗(yàn)證等方面的基本要求與規(guī)范。

背景：

當(dāng)今的腫瘤診治已經(jīng)進(jìn)入個(gè)體化及正確醫(yī)學(xué)時(shí)代，需要充分分析腫瘤從發(fā)生到轉(zhuǎn)歸的整個(gè)疾病進(jìn)程中的驅(qū)動(dòng)基因及其變異，從而選擇有效的靶向治療方案。為此，中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)于2015年9月17日在廈門市召集了我國(guó)具有代表性的腫瘤學(xué)專家、病理及分子生物學(xué)專家及NGS技術(shù)專家，成立了“中國(guó)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因分析聯(lián)盟”（China Actionable Genome Consortium，CAGC）并啟動(dòng)了正確腫瘤學(xué)研究項(xiàng)目（Precision Oncology Initiative，即CAGC POI），確立了整體項(xiàng)目的組織框架和內(nèi)容框架。CAGC-POI計(jì)劃先進(jìn)階段擬在初步建立二代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing, NGS）臨床應(yīng)用共識(shí)的基礎(chǔ)上，在肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌等惡性實(shí)體瘤開(kāi)展以NGS技術(shù)為主的驅(qū)動(dòng)基因譜分析。2015年9月27日經(jīng)CSCO理事長(zhǎng)吳一龍教授與中華醫(yī)學(xué)會(huì)會(huì)長(zhǎng)陳竺院士和陳賽娟院士討論后決定，將造血系統(tǒng)腫瘤作為第6個(gè)瘤種納入CAGC POI計(jì)劃，主要是針對(duì)白血病等開(kāi)展較之以前更為廣泛的基因變異譜分析。在上述共識(shí)建立、主要6個(gè)瘤種的變異譜分析驗(yàn)證、優(yōu)化流程的基礎(chǔ)上，將在攜帶有臨床“可靶向作用”驅(qū)動(dòng)基因的患者中，開(kāi)展相應(yīng)的靶向正確診治的實(shí)踐與試驗(yàn)研究。賊終提出適合我國(guó)臨床腫瘤學(xué)實(shí)踐的NGS檢測(cè)技術(shù)、分析內(nèi)容、診治模式的共識(shí)、標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，克服NGS實(shí)驗(yàn)室與臨床應(yīng)用之間的障礙，提高為腫瘤患者服務(wù)的質(zhì)量和能力。

本階段共識(shí)建立是CAGC POI項(xiàng)目的先進(jìn)階段，將由專家組提出NGS技術(shù)在臨床腫瘤學(xué)應(yīng)用的共識(shí)內(nèi)容。在廣泛收集相關(guān)的建議和意見(jiàn)的基礎(chǔ)上，修訂為指導(dǎo)下一階段技術(shù)檢測(cè)的共識(shí)性文件，供腫瘤學(xué)相關(guān)臨床和檢測(cè)人員等參考。

技術(shù)引言：

當(dāng)今的二代測(cè)序技術(shù)（NGS）是高通量的大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)，可同步獲得腫瘤患者個(gè)體特定樣本中數(shù)十億以上的DNA堿基序列信息。NGS有明顯的通量?jī)?yōu)勢(shì)及發(fā)現(xiàn)未知基因變異的優(yōu)勢(shì)，但是在使用中也存在包括檢測(cè)技術(shù)、數(shù)據(jù)管理、分析與報(bào)告、解讀與臨床咨詢等方面的各種挑戰(zhàn)。既往的文獻(xiàn)及國(guó)際相關(guān)共識(shí)已經(jīng)總結(jié)和報(bào)道了NGS在單基因遺傳病、產(chǎn)前診斷等方面的應(yīng)用。而在臨床腫瘤學(xué)的實(shí)踐中，基因檢測(cè)已經(jīng)成為正確診治的前提和核心內(nèi)容之一，但缺乏統(tǒng)一的共識(shí)。腫瘤基因檢測(cè)范圍越來(lái)越廣，已經(jīng)由單基因的分析，逐步走向數(shù)個(gè)至數(shù)百個(gè)基因的多重分析。在未來(lái)，腫瘤臨床實(shí)踐中甚至可能需要針對(duì)外顯子組、轉(zhuǎn)錄組、全基因組、表觀遺傳組的信息分析和應(yīng)用。另一方面，由于生物技術(shù)也在不斷進(jìn)步，因此可以預(yù)見(jiàn)的是，在未來(lái)的一段時(shí)間，高通量技術(shù)NGS在臨床診斷和正確治療中的應(yīng)用將會(huì)在檢測(cè)技術(shù)、分析內(nèi)容、解讀等方面會(huì)一直產(chǎn)生變化，也會(huì)帶來(lái)在實(shí)踐應(yīng)用中的各種挑戰(zhàn)。

在現(xiàn)階段，我國(guó)社會(huì)的腫瘤患者數(shù)目龐大，驅(qū)動(dòng)基因診斷和檢測(cè)應(yīng)用需求巨大。但在實(shí)際應(yīng)用中會(huì)因?yàn)闄z測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)入門檻低、缺乏臨床公認(rèn)的NGS指導(dǎo)規(guī)范，腫瘤診治中可能存在檢測(cè)質(zhì)量低下、結(jié)果正確性差，檢測(cè)結(jié)果解讀不專業(yè)，甚至盲目追求基因檢測(cè)結(jié)果的現(xiàn)象。因此，我國(guó)腫瘤學(xué)界亟需對(duì)當(dāng)前NGS在臨床合理規(guī)范的使用進(jìn)行充分討論，形成共識(shí)予以發(fā)布，以指導(dǎo)我國(guó)臨床腫瘤診療中的規(guī)范應(yīng)用。

本技術(shù)共識(shí)闡述了NGS技術(shù)質(zhì)量需求、臨床腫瘤相關(guān)NGS檢測(cè)內(nèi)容、樣本處理、測(cè)序流程、數(shù)據(jù)管理、信息學(xué)分析、結(jié)果報(bào)告解釋和咨詢等多個(gè)方面的內(nèi)容。本共識(shí)也對(duì)患者知情同意、測(cè)試項(xiàng)目的質(zhì)控、研究與診斷的應(yīng)用差別等內(nèi)容進(jìn)行了說(shuō)明。
 

1. NGS在臨床腫瘤診斷中的質(zhì)量需求：

NGS技術(shù)正處于不斷的發(fā)展和完善過(guò)程中，需要對(duì)NGS技術(shù)現(xiàn)狀有正確的認(rèn)識(shí)。但過(guò)去十年腫瘤學(xué)界的研究和應(yīng)用顯示：在恰當(dāng)?shù)募夹g(shù)條件下，NGS確實(shí)能夠高通量地檢測(cè)分析腫瘤中的驅(qū)動(dòng)基因，給部分患者帶來(lái)治療和生存的獲益。

在臨床實(shí)踐中各實(shí)驗(yàn)室可能有不同的NGS技術(shù)平臺(tái)。無(wú)論使用何種平臺(tái)，各實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)該按照本共識(shí)中的推薦（聲明）開(kāi)展NGS項(xiàng)目測(cè)試，對(duì)平臺(tái)及相關(guān)分析工具進(jìn)行驗(yàn)證后才應(yīng)用于臨床。

針對(duì)腫瘤的多基因檢測(cè)，需要設(shè)計(jì)特定的NGS測(cè)試項(xiàng)目（test）。這些項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)能夠明確回答臨床診療所需的基因狀態(tài)。需要明確指出的是，應(yīng)該避免分析技術(shù)能力尚未得到充分驗(yàn)證的NGS項(xiàng)目在臨床應(yīng)用。

聲明1：臨床腫瘤診斷應(yīng)用的NGS項(xiàng)目應(yīng)符合相應(yīng)的診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。未進(jìn)行充分驗(yàn)證的NGS技術(shù)不應(yīng)該在臨床實(shí)踐的驅(qū)動(dòng)基因診斷中應(yīng)用。相關(guān)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該明確能夠提供的檢測(cè)項(xiàng)目的內(nèi)容范圍和相關(guān)技術(shù)參數(shù)。

（注：文中的“聲明”（statement）是專家組討論的各個(gè)要點(diǎn)，也即專家組形成的共識(shí)或推薦）

NGS用于臨床腫瘤分子診斷能夠帶來(lái)明確的益處（utility）。NGS技術(shù)優(yōu)勢(shì)：一次性、特定時(shí)間（約10個(gè)工作日）產(chǎn)生覆蓋基因組特定區(qū)域（從數(shù)個(gè)基因到數(shù)百個(gè)基因以至外顯子組、轉(zhuǎn)錄組或全基因組）的通量數(shù)據(jù)，同步獲得多基因、多位點(diǎn)、多種變異形式的分子檢測(cè)結(jié)果。盡管目前NGS的多基因多重分析總成本較高，但相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法而言，單個(gè)基因單個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)費(fèi)用已大大下降。

影響NGS結(jié)果的限制性因素包括：平臺(tái)類別、靶區(qū)域富集方法、文庫(kù)構(gòu)建及擴(kuò)增效率、測(cè)序數(shù)據(jù)量、生物信息學(xué)分析流程等。在臨床應(yīng)用之前，對(duì)于特定突變位點(diǎn)的NGS檢測(cè)結(jié)果在低質(zhì)量數(shù)據(jù)條件下應(yīng)采用其他方法進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的專家、腫瘤患者的主診醫(yī)生與患者應(yīng)該就開(kāi)展腫瘤NGS分析的利弊進(jìn)行充分溝通和知情同意，同時(shí)讓臨床醫(yī)生了解特定NGS測(cè)試項(xiàng)目的醫(yī)學(xué)意義。

聲明2：NGS檢測(cè)項(xiàng)目（Test）的目的和臨床益處（utility）應(yīng)該明確，如果是用于臨床靶點(diǎn)抑制劑（靶向藥物）的使用決策參考，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)該能夠明確一些在臨床可采取特定藥物靶向治療的靶點(diǎn)變異信息。NGS測(cè)試項(xiàng)目如果是用于分子分型、療效預(yù)測(cè)或預(yù)后判斷則需要在發(fā)現(xiàn)集（discovery set）的基礎(chǔ)上建立分析模型，再通過(guò)技術(shù)和驗(yàn)證集（validation set）的驗(yàn)證方可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床。

2. NGS在臨床腫瘤應(yīng)用的檢測(cè)內(nèi)容：

在臨床實(shí)踐中，不同的瘤種既可存在瘤種特異性的驅(qū)動(dòng)基因變異，也可能存在共同的基因變異。一個(gè)瘤種存在眾多的分子變異亞型，從而提出“同病異治”或“分型而治”的策略；不同瘤種之間由于存在共同的驅(qū)動(dòng)基因分型，則可以采取“異病同治”的策略。由此可見(jiàn)，臨床腫瘤的基于基因或基因組學(xué)的分子分型將逐步超越傳統(tǒng)的病理組織形態(tài)學(xué)分型，成為臨床診治腫瘤的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

腫瘤的多基因分型對(duì)藥物研發(fā)策略也產(chǎn)生了重大影響。在藥物臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，近年來(lái)出現(xiàn)了兩種基于分子靶點(diǎn)的試驗(yàn)研究設(shè)計(jì)類型。一種是“雨傘”設(shè)計(jì)類型（Umbrella trial design），即針對(duì)單個(gè)瘤種的基于多個(gè)驅(qū)動(dòng)基因分型及其靶向治療，另一種則是“籃子”設(shè)計(jì)類型（Basket trial design），是針對(duì)多個(gè)瘤種的驅(qū)動(dòng)基因的“同型同治”。

無(wú)論是臨床實(shí)踐還是臨床試驗(yàn)，用于基因分型的NGS檢測(cè)項(xiàng)目?jī)?nèi)容需要精細(xì)的設(shè)計(jì)和技術(shù)高效性的驗(yàn)證。NGS項(xiàng)目的檢測(cè)內(nèi)容應(yīng)明確檢測(cè)哪些基因、相應(yīng)基因的受檢區(qū)域、靶點(diǎn)的變異信息等。

聲明3：如果NGS用于臨床分子診斷，應(yīng)該明確至少哪些基因需要納入檢測(cè)名單（panel list）中。這個(gè)必須的“核心基因清單”（core gene list）需要特定腫瘤亞?？葡嚓P(guān)的臨床和實(shí)驗(yàn)室多學(xué)科專家共同討論后制定。

“核心基因清單”論證及制定過(guò)程中應(yīng)以“患者的利益”為中心，充分整合臨床腫瘤學(xué)家對(duì)于正確診治的觀點(diǎn)，并充分考慮在我國(guó)推廣應(yīng)用的可操作性。以肺癌為例: 目前NCCN及國(guó)內(nèi)肺癌臨床指南或衛(wèi)計(jì)委診療規(guī)范都明確指出EGFR突變、KRAS突變、ALK重排（融合）、ROS1重排（融合）、MET 14號(hào)外顯子可變剪切變異、MET拷貝數(shù)擴(kuò)增、RET重排（融合）、HER2突變或擴(kuò)增、BRAF突變等驅(qū)動(dòng)基因變異是臨床實(shí)踐中的重要必須基因。

從CAGC POI項(xiàng)目的惡性腫瘤的整體角度考慮，檢測(cè)內(nèi)容（gene panel及其基因組區(qū)域）應(yīng)該既包括各瘤種特異性的panel，也應(yīng)備有一個(gè)大而全的gene panel。因?qū)嶓w瘤和血液腫瘤的變異譜方面的差異較大，因此，在大而全的panel中對(duì)實(shí)體瘤和血液腫瘤應(yīng)該分別設(shè)計(jì)。

“可靶向作用”的原理及定義：驅(qū)動(dòng)基因的定義是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等疾病進(jìn)程中關(guān)鍵步驟的基因。“可靶向作用”基因則是指針對(duì)該驅(qū)動(dòng)基因的變異靶點(diǎn)或其上下游關(guān)鍵分子，能夠采用靶向藥物等手段進(jìn)行治療，從而達(dá)到抑制腫瘤進(jìn)展或消退腫瘤的治療效果。可靶向作用基因也可指該基因的變異可以用來(lái)作為明確的分子亞型診斷或預(yù)后判斷。

聲明4：“可靶向作用基因”的變異可能會(huì)影響臨床決策，醫(yī)生需要根據(jù)基因分型的檢測(cè)結(jié)果來(lái)指導(dǎo)臨床診療方案。“可靶向作用基因”的變異可分為兩大類，先進(jìn)類（Level 1 actionable alterations）包括國(guó)際、國(guó)內(nèi)指南（CSCO、ASCO、NCCN、ESMO等）中明確指定的、藥物標(biāo)簽中說(shuō)明的、與FDA/CFDA批準(zhǔn)的適應(yīng)癥相關(guān)的臨床分型基因變異，或是具有明確的分子診斷或預(yù)后判斷價(jià)值的基因變異。第二類（Level 2 actionable alterations）包括正在開(kāi)展的任何期別（I-III期）臨床試驗(yàn)中的藥物相關(guān)靶點(diǎn)、在已經(jīng)或即將開(kāi)展的臨床試驗(yàn)中作為入組條件的變異靶點(diǎn)、在國(guó)內(nèi)外指南中其他腫瘤或疾病適應(yīng)癥的藥物靶點(diǎn)、用于輔助診斷或預(yù)后判斷的靶點(diǎn)等。在NGS檢測(cè)中，對(duì)于臨床意義非常明確的體細(xì)胞突變的少數(shù)基因集分析，可以直接檢測(cè)腫瘤標(biāo)本而無(wú)須設(shè)置白細(xì)胞等對(duì)照樣本。但對(duì)于需要包含上述第二類可靶向作用基因的更大的基因集分析，尤其是數(shù)百基因乃至全外顯子組測(cè)序等，建議在腫瘤樣本進(jìn)行NGS檢測(cè)時(shí)設(shè)置患者自身白細(xì)胞樣本對(duì)照分析。

聲明5：隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究的不斷深入，新的靶點(diǎn)及藥物會(huì)得到不斷的發(fā)現(xiàn)和研發(fā)。因此有必要定期或不定期依據(jù)重要的臨床研究進(jìn)展對(duì)檢測(cè)內(nèi)容進(jìn)行討論并發(fā)布更新。

聲明6：檢測(cè)基因數(shù)量越多，診斷信息會(huì)越多。但由于腫瘤信號(hào)通路的冗余性和復(fù)雜性，在基因清單中，除了“核心基因”之外，應(yīng)該對(duì)其他增加的每個(gè)基因進(jìn)行明確定義注釋，說(shuō)明其基因型與潛在可靶向作用位點(diǎn)或通路的關(guān)系。在實(shí)際的NGS測(cè)試項(xiàng)目應(yīng)用中，檢測(cè)基因數(shù)量的增加不應(yīng)以核心基因的檢測(cè)質(zhì)量受損為代價(jià)。

技術(shù)參數(shù)驗(yàn)證對(duì)高效檢測(cè)結(jié)果的正確性很重要。所有NGS計(jì)量參數(shù)都應(yīng)該明確說(shuō)明。在檢測(cè)中應(yīng)該記錄批次或分析樣本特異性的特征。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該利用結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)高效平臺(tái)、各分析項(xiàng)目、樣本處理等方面的質(zhì)量分析。在檢測(cè)分析流程中，每個(gè)樣本都應(yīng)該做好少有性標(biāo)識(shí)。在平臺(tái)穩(wěn)定性驗(yàn)證中，應(yīng)該使得所有儀器和試劑都符合標(biāo)準(zhǔn)要求，提供特定驅(qū)動(dòng)基因的正確性和正確性。
技術(shù)驗(yàn)證過(guò)程中應(yīng)該記錄在案的相關(guān)內(nèi)容或參數(shù)包括以下幾方面。1．樣本相關(guān)的患者信息保護(hù)原則、少有性標(biāo)識(shí)、接收、存儲(chǔ)、處理各步驟內(nèi)容及時(shí)間；2. 實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中DNA/RNA處理每一步驟所用試劑名稱、生產(chǎn)廠家、批號(hào)，記錄每一步操作后的質(zhì)量指標(biāo)（如RIN等）；3．?dāng)?shù)據(jù)分析及數(shù)據(jù)庫(kù)管理相關(guān)的軟件（包括版本號(hào)，分析時(shí)所用各項(xiàng)參數(shù)）、數(shù)據(jù)的相關(guān)參數(shù)（數(shù)據(jù)量大小，QC等）、數(shù)據(jù)庫(kù)的安全性和備份情況等。

聲明7: NGS項(xiàng)目的檢測(cè)流程和生物信息學(xué)分析需要針對(duì)特定平臺(tái)和分析項(xiàng)目進(jìn)行充分優(yōu)化。流程驗(yàn)證中應(yīng)提供分析敏感性和特異性的參數(shù)。因?yàn)榉治龇椒ǖ牟町?，針?duì)SNV、INDEL、重排（融合）、CNV等不同的變異應(yīng)該分別測(cè)試技術(shù)的敏感度和特異度。受樣本取材或探針設(shè)計(jì)等因素影響或限制，NGS在某些變異類型如拷貝數(shù)擴(kuò)增的檢測(cè)方面有時(shí)存在一定的局限性。對(duì)于NGS方法正確性可能有影響的情況，應(yīng)考慮采用高效的單基因方法對(duì)檢出變異進(jìn)行驗(yàn)證。
 

3. NGS應(yīng)用中的樣本處理：

NGS檢測(cè)需文庫(kù)構(gòu)建，該步驟原始材料為DNA或來(lái)自RNA的cDNA。適合臨床NGS分析的樣本類型優(yōu)先選擇新鮮組織標(biāo)本，也可選用甲醛固定石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）樣本、腫瘤細(xì)胞學(xué)標(biāo)本及血漿（游離DNA/RNA）等。

NGS可用于疾病初診時(shí)的分子靶點(diǎn)分析，也可用于治療中疾病進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的監(jiān)測(cè)及耐藥分子機(jī)制的診斷。因而在疾病的全程管理中可合理地考慮在診療的關(guān)鍵時(shí)間節(jié)點(diǎn)收集臨床標(biāo)本進(jìn)行NGS分析。決定是否采用NGS在多個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的檢測(cè)分析應(yīng)做好多學(xué)科討論和充分的知情同意。

各類樣本采集：（1）對(duì)于手術(shù)和活檢的新鮮組織：理想的保存方法是迅速置于液氮中，可保存于液氮罐或-80℃冰箱，該過(guò)程應(yīng)在手術(shù)離體后30分鐘內(nèi)完成，以防止RNA等核酸降解；或采用保存在樣本保護(hù)劑中，盡早轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存?？刹捎美鋬銮衅旧u(píng)估樣本中的腫瘤細(xì)胞含量。（2）甲醛固定石蠟包埋組織（formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）：按病理操作規(guī)范進(jìn)行取材。手術(shù)或活檢離體的組織應(yīng)在30分鐘內(nèi)浸入10%中性福爾馬林溶液中進(jìn)行固定，避免使用酸性及含有重金屬離子的固定液。大標(biāo)本應(yīng)切開(kāi)后充分固定至6-48小時(shí)，不超過(guò)72小時(shí)。小活檢標(biāo)本可固定6-12小時(shí)。開(kāi)展NGS檢測(cè)前應(yīng)進(jìn)行HE染色評(píng)估腫瘤細(xì)胞的含量。（3）細(xì)胞學(xué)樣本：胸腹水中的腫瘤細(xì)胞用于基因檢測(cè)時(shí)，必須確認(rèn)是否有腫瘤細(xì)胞存在。細(xì)胞病理檢查之后，符合質(zhì)量要求的標(biāo)本可直接抽提核酸，也可以制備成FFPE細(xì)胞學(xué)蠟塊進(jìn)行后續(xù)分析。（4）血漿或血液樣本：循環(huán)游離/腫瘤DNA(circulating free/tumor DNA，cf/ctDNA)是存在于血漿中的游離DNA，腫瘤來(lái)源的DNA占血漿游離DNA的比例在不同腫瘤及病例中相差懸殊。采集外周血提取血漿游離DNA進(jìn)行檢測(cè)，取樣時(shí)應(yīng)使用一次性的EDTA抗凝真空采血管，采集8~10ml全血，冷藏運(yùn)輸，2小時(shí)內(nèi)分離血漿，提取游離DNA，保存到-80℃冰箱中，并避免反復(fù)凍融。如外周血需要長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸，建議用商品化的游離DNA樣本專用保存管，在常溫條件下，cfDNA在全血中可穩(wěn)定保存3－7天。由于血細(xì)胞基因組DNA（gDNA）的潛在大量釋放會(huì)極大地稀釋血漿游離腫瘤DNA的濃度，經(jīng)肉眼觀察確認(rèn)為溶血的樣本不適用于對(duì)游離腫瘤DNA的NGS檢測(cè)。當(dāng)懷疑血漿游離DNA受到血細(xì)胞基因組DNA污染時(shí)，可考慮采用核酸片段大小分布分析來(lái)判斷污染是否存在，而從判斷樣本是否適用于NGS檢測(cè)。

采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià)對(duì)后續(xù)結(jié)果的解讀有重要意義，臨床樣本的采樣過(guò)程、分析前的運(yùn)輸和處理流程以及病理的評(píng)估結(jié)果等均應(yīng)做相應(yīng)的記錄。質(zhì)量評(píng)價(jià)的內(nèi)容應(yīng)包括腫瘤細(xì)胞含量比例、腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，是否按照要求進(jìn)行處理與運(yùn)輸?shù)?。評(píng)價(jià)方法包括肉眼觀察、顯微鏡下觀察和血漿樣本核酸濃度分析等。對(duì)于腫瘤細(xì)胞分布集中的區(qū)域應(yīng)進(jìn)行標(biāo)注，必要時(shí)進(jìn)行顯微切割后再提取核酸。
樣本采集和處理中的防污染：樣本采集賊好采用一次性材料；制備不同患者病理切片樣本時(shí)，需更換新刀片，并清除操作器皿或切片機(jī)上先前樣本的殘留。

樣本運(yùn)送和保存：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立詳細(xì)的樣本運(yùn)送標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），對(duì)臨床醫(yī)生提供樣本采集手冊(cè)，要求物流人員填寫(xiě)相關(guān)運(yùn)送記錄表，確保運(yùn)送過(guò)程中各類樣本的安全性和過(guò)程的可控性。石蠟材料可常溫運(yùn)輸，血漿樣本干冰條件下運(yùn)輸，核酸樣本需要在4攝氏度或冷凍條件下運(yùn)輸。

聲明8：為了提高NGS檢測(cè)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因的正確性，應(yīng)該提供高質(zhì)量的臨床生物材料樣本。不同類型生物材料的收集及處理均應(yīng)有明確的標(biāo)準(zhǔn)操作流程（SOP）指導(dǎo)。

聲明9：樣本登記過(guò)程中每個(gè)標(biāo)本應(yīng)該在NGS分析中有少有性標(biāo)識(shí)。包括來(lái)自同一患者的不同組織病灶、不同組織切片、不同核酸樣本等均有少有性的標(biāo)識(shí)。

聲明10：樣本評(píng)估和用量：除了血漿或血液來(lái)源的DNA/RNA，凡是涉及形態(tài)學(xué)的標(biāo)本，應(yīng)該在顯微鏡下評(píng)估腫瘤細(xì)胞的含量，充分記錄各類形態(tài)學(xué)惡性細(xì)胞的含量比例。評(píng)估記錄還應(yīng)包括標(biāo)本收集和處理方法。腫瘤細(xì)胞比例低的標(biāo)本必要時(shí)應(yīng)采用包括顯微微切割在內(nèi)的有效富集腫瘤細(xì)胞的方法，提高腫瘤細(xì)胞比例。一般情況下，適合于NGS檢測(cè)的組織標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞含量建議應(yīng)達(dá)到20%以上。如果腫瘤細(xì)胞占比較低，患者知情后依然愿意進(jìn)行NGS檢測(cè)，應(yīng)該盡量采用顯微切割技術(shù)富集腫瘤細(xì)胞，或增加NGS測(cè)序 數(shù)據(jù)量以提高測(cè)序覆蓋深度（depth），并在報(bào)告中提示樣本局限性。組織樣本抽提獲得的DNA量應(yīng)達(dá)50ng以上用于NGS檢測(cè)。血液樣本建議采血至少8ml，分離血漿游離DNA用于NGS檢測(cè)。

聲明11：核酸樣本抽提及QC/QA。組織DNA與血漿游離DNA等核酸樣本均應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)前的質(zhì)量控制分析，包括核酸的濃度和純度分析。組織DNA樣本應(yīng)該進(jìn)行核酸完整性分析，以判斷DNA質(zhì)量。血漿游離DNA樣本應(yīng)該進(jìn)行片段長(zhǎng)度分布分析，以判斷是否存在血細(xì)胞基因組DNA的污染。在文庫(kù)構(gòu)建后應(yīng)該對(duì)核酸樣本進(jìn)行濃度測(cè)定與文庫(kù)片段分布等質(zhì)量控制。

聲明12：為了便于后續(xù)采用其他技術(shù)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，在樣本留取時(shí)，應(yīng)適當(dāng)考慮增加生物材料的留取量。在石蠟標(biāo)本的切片過(guò)程中可考慮適當(dāng)同步預(yù)留幾張切片用于后續(xù)IHC、FISH、PCR測(cè)序等方法驗(yàn)證。

4. NGS測(cè)序 技術(shù)及流程：

NGS又稱大規(guī)模平行測(cè)序（MPS），是一次性產(chǎn)生大量數(shù)字化基因序列的測(cè)序技術(shù)，是繼Sanger測(cè)序之后的革命性進(jìn)步。NGS能夠同時(shí)對(duì)上百萬(wàn)甚至數(shù)十億個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模、高通量測(cè)序的目標(biāo)。高通量測(cè)序技術(shù)不僅可以進(jìn)行大規(guī)模基因組序列的測(cè)序，還可用于基因表達(dá)分析、非編碼小分子RNA的鑒定、DNA甲基化等相關(guān)分析。

目前在臨床腫瘤實(shí)踐中，NGS主要應(yīng)用于驅(qū)動(dòng)基因測(cè)序，是腫瘤正確診療的重要環(huán)節(jié)。NGS的優(yōu)勢(shì)包括：一次性通量測(cè)序、能夠分析變異豐度、相對(duì)成本低。存在的不足之處包括：滿足臨床應(yīng)用的生物信息分析軟件尚處于發(fā)展之中、基因型的判讀依賴于生物信息的正確分析、測(cè)序深度在必要時(shí)因整體成本高而難以達(dá)到等。

就NGS技術(shù)本身而言，在臨床腫瘤診斷和監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用應(yīng)充分關(guān)注試劑管理、樣本的QA/QC、檢測(cè)環(huán)境、人員資質(zhì)和熟練程度、NGS技術(shù)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)（包括文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序流程、質(zhì)控等）等環(huán)節(jié)，以標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范加以約束，以高效特定腫瘤NGS測(cè)試（test）能夠穩(wěn)定正確地發(fā)揮作用。

測(cè)序技術(shù)的各個(gè)環(huán)節(jié)應(yīng)該做好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范記錄，賊好有結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行管理，包括平臺(tái)環(huán)境參數(shù)、試劑使用和性能、樣本追蹤、質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)等管理。通過(guò)日常和定期分析質(zhì)控高效檢測(cè)的正確性。
為滿足臨床需求，實(shí)驗(yàn)室需對(duì)各個(gè)質(zhì)量控制步驟出現(xiàn)異常、失敗的樣本規(guī)定合理的備選方案。比如采用其他分子診斷平臺(tái)檢測(cè)一部分重要位點(diǎn)，或?qū)﹃?yáng)性位點(diǎn)采用其他平臺(tái)確認(rèn)性檢測(cè)，或者重復(fù)高通量測(cè)序流程等，有條件的檢測(cè)單位也可以重新選取標(biāo)本。

聲明13：NGS檢測(cè)需要符合嚴(yán)格的檢測(cè)環(huán)境要求，各類樣本的儲(chǔ)存、核酸抽提處理及NGS分析應(yīng)在通過(guò)審核驗(yàn)收的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室完成。

聲明14：NGS試劑管理和質(zhì)控：NGS試劑應(yīng)該獨(dú)立存放，防止交叉污染。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室自配試劑或探針及采購(gòu)試劑，均需做好每批試劑的性能評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)合格后才可用于臨床樣本分析。

聲明15：每個(gè)特定的NGS測(cè)試項(xiàng)目（test）都需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的技術(shù)驗(yàn)證合格后才可以用于臨床腫瘤檢測(cè)。診斷測(cè)試項(xiàng)目必須在正確性、分析敏感度、特異度、正確性等方面進(jìn)行充分評(píng)價(jià)。如果檢測(cè)項(xiàng)目中的試劑或步驟有任何主要變更，則質(zhì)量參數(shù)需要重新評(píng)價(jià)。在針對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目更新或升級(jí)的重新評(píng)價(jià)中，應(yīng)該明確測(cè)試所需要的樣本類型及例數(shù)。強(qiáng)烈建議各實(shí)驗(yàn)室參加NGS相關(guān)的室間質(zhì)量評(píng)估項(xiàng)目來(lái)評(píng)測(cè)檢測(cè)能力和質(zhì)量。

聲明16：明確的檢測(cè)流程包括樣本QC/QA、樣本預(yù)處理、接頭連接、預(yù)擴(kuò)增、基因組合（gene panel）靶區(qū)的捕獲、靶區(qū)純化、擴(kuò)增文庫(kù)構(gòu)建、QC定量后上NGS測(cè)序 儀檢測(cè)等步驟。每個(gè)步驟的操作和質(zhì)量控制都應(yīng)建立SOP進(jìn)行指導(dǎo)。如果使用擴(kuò)增子（amplicon）建庫(kù)的方式，同樣需要建立相應(yīng)的SOP進(jìn)行質(zhì)控管理。

聲明17：NGS的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括上述樣本預(yù)處理至文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序、質(zhì)控的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，也包括原始數(shù)據(jù)產(chǎn)生和管理、信息學(xué)分析過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化。由此CAGC將在下一階段可行性驗(yàn)證基礎(chǔ)上形成一套NGS技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)文件（SOP）。

聲明18：人員配備和熟練程度應(yīng)滿足實(shí)踐需求。應(yīng)配有專門的質(zhì)控人員。對(duì)于參與NGS實(shí)驗(yàn)流程操作的技術(shù)人員進(jìn)行充分的培訓(xùn)，達(dá)到一定的熟練程度。每個(gè)平臺(tái)應(yīng)有技術(shù)員專職從事實(shí)驗(yàn)操作。

聲明19：“核心基因清單”與相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品將被用于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室間的質(zhì)控比較。根據(jù)檢測(cè)驅(qū)動(dòng)基因的突變結(jié)果描述、目的區(qū)域的覆蓋度等建立評(píng)分體系。這個(gè)評(píng)分體系將用于對(duì)實(shí)驗(yàn)室間NGS檢測(cè)能力的分析與認(rèn)證。
 

5. NGS數(shù)據(jù)的產(chǎn)生、管理、信息學(xué)分析：

由于NGS數(shù)據(jù)龐大，數(shù)據(jù)管理、儲(chǔ)存和分析需要強(qiáng)大的計(jì)算平臺(tái)支持。數(shù)據(jù)的質(zhì)量檢查、信息學(xué)分析、輸出格式、儲(chǔ)存等方面都應(yīng)有標(biāo)準(zhǔn)SOP支持。賊好有結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)管理原始數(shù)據(jù)、質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)以及分析結(jié)果數(shù)據(jù)等。

聲明20：數(shù)據(jù)分析工具（軟件）的能力驗(yàn)證。需要采用適量例數(shù)的原始數(shù)據(jù)針對(duì)NGS數(shù)據(jù)分析工具進(jìn)行驗(yàn)證分析。通過(guò)采用攜帶不同種類與豐度變異的數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證整個(gè)分析流程的正確性與穩(wěn)定性。特別是在增加檢測(cè)基因的內(nèi)容時(shí)需要驗(yàn)證分析工具的高效性。分析工具的能力驗(yàn)證應(yīng)有詳細(xì)的內(nèi)部軟件驗(yàn)證記錄。CSCO CAGC項(xiàng)目也將組織開(kāi)展軟件分析能力驗(yàn)證。

聲明21：數(shù)據(jù)產(chǎn)生和管理儲(chǔ)存。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室必須采用結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)注釋SNP、Indel、重排（融合）、CNV等各類變異信息。

聲明22：數(shù)據(jù)儲(chǔ)存應(yīng)該采用通用的FASTQ、BAM、VCF格式，便于數(shù)據(jù)交換及實(shí)驗(yàn)室間評(píng)價(jià)。同時(shí)保存完整的log日志文件，便于區(qū)別流程版本信息、追溯異常結(jié)果來(lái)源及分析原始數(shù)據(jù)向診斷報(bào)告生成的可重復(fù)性。診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該長(zhǎng)期保存相關(guān)的數(shù)據(jù)集（至少15年）。

聲明23：NGS原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量檢查，應(yīng)有嚴(yán)格的操作規(guī)程指導(dǎo)。所有參數(shù)需與檢測(cè)性能評(píng)價(jià)過(guò)程中的參數(shù)進(jìn)行比較，設(shè)置并執(zhí)行接受與拒絕的標(biāo)準(zhǔn)。參見(jiàn)表1。

表1. 基于原始序列(FASTQ)和比對(duì)后序列(BAM)質(zhì)量的計(jì)量參數(shù)

變異檢測(cè)質(zhì)量的相關(guān)計(jì)量參數(shù)

聲明24：數(shù)據(jù)分析的流程包括初步分析、接頭序列去除、引物序列去除、低質(zhì)量序列去除、參照基因組序列比對(duì)（mapping）、去重、Indel重復(fù)比對(duì)、堿基質(zhì)量得分校正、突變識(shí)別（variant calling）、注釋、過(guò)濾后輸出等流程（見(jiàn)下表2）。CAGC POI項(xiàng)目需要在各個(gè)瘤種中的每一步都應(yīng)做到同質(zhì)性。

表2. 臨床腫瘤NGS測(cè)序 的簡(jiǎn)單流程步驟描述

聲明25：體細(xì)胞與胚系來(lái)源的變異應(yīng)該加以區(qū)分。體細(xì)胞突變?cè)谀[瘤診療中的臨床意義較大。特定的胚系突變的生物學(xué)意義需要說(shuō)明，如乳腺癌中BRCA1/2的突變。

聲明26：應(yīng)對(duì)各個(gè)瘤種中與臨床意義相關(guān)的變異重點(diǎn)進(jìn)行關(guān)注分析和說(shuō)明，比如肺癌中的EGFR exons 18-21突變、ALK重排、ROS重排、MET E14拼接變異、HER2插入突變或擴(kuò)增等突變的說(shuō)明。

近年來(lái)，關(guān)于腫瘤細(xì)胞分子異質(zhì)性的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，腫瘤中存在不同分子變異亞型的亞克隆。異質(zhì)性亞克隆的存在會(huì)影響腫瘤疾病的整體進(jìn)化路徑及對(duì)靶向治療的應(yīng)答和耐藥。因此NGS用于腫瘤診斷或耐藥監(jiān)測(cè)時(shí)需要達(dá)到較深的測(cè)序覆蓋度，這樣才能充分解釋腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)化過(guò)程中的異質(zhì)性及其與臨床表型的關(guān)系。

聲明27：CAGC建議，臨床腫瘤組織樣本的NGS檢測(cè)數(shù)據(jù)中測(cè)序“有效深度”應(yīng)該達(dá)到 500X以上；血漿游離DNA標(biāo)本的NGS“有效測(cè)序深度”應(yīng)該達(dá)到1000X以上。
說(shuō)明：（1）有效深度定義為去除PCR重復(fù)reads（duplicates）之后的深度；（2）應(yīng)該在80%以上的目標(biāo)捕獲區(qū)域達(dá)到這個(gè)深度，而非是所有區(qū)域的平均，否則在區(qū)域間覆蓋波動(dòng)較大的情況下會(huì)有大量區(qū)域出現(xiàn)覆蓋不夠的情況。

聲明28：CAGC項(xiàng)目數(shù)據(jù)的管理應(yīng)該在標(biāo)準(zhǔn)流程和各類數(shù)據(jù)管理方面實(shí)現(xiàn)同一化。在后續(xù)將開(kāi)展每個(gè)瘤種約100例的分析，從而對(duì)本次共識(shí)的可操作性進(jìn)行驗(yàn)證。
 

6. NGS結(jié)果報(bào)告與咨詢：

NGS是多步驟的復(fù)雜的檢測(cè)和分析方法，產(chǎn)生報(bào)告的內(nèi)容較多。對(duì)臨床而言需要遵循首頁(yè)簡(jiǎn)明、結(jié)果明確、解釋清楚、信息充分的原則。

在開(kāi)展NGS臨床測(cè)試之前，應(yīng)明確定義所檢測(cè)的驅(qū)動(dòng)基因在基因組上的哪些靶區(qū)域范圍（target range），并在報(bào)告中告知臨床醫(yī)生。

NGS報(bào)告結(jié)果應(yīng)該簡(jiǎn)明清晰。具有臨床靶向意義的檢測(cè)結(jié)果及其參數(shù)應(yīng)該優(yōu)先報(bào)告，如EGFR L858R突變，突變位點(diǎn)占比（mutant allele fraction, MAF）=15.6%。在報(bào)告首頁(yè)中應(yīng)包括患者ID、臨床診斷、測(cè)試的簡(jiǎn)單描述、技術(shù)類型等信息。根據(jù)情況，報(bào)告可以適當(dāng)添加附件成多頁(yè)。各個(gè)瘤種的“核心基因”檢測(cè)結(jié)果必須明確報(bào)告，其他基因根據(jù)結(jié)果概括性報(bào)告，對(duì)于特別的突變（如在其他腫瘤中發(fā)現(xiàn)是核心變異）可特別進(jìn)行報(bào)告。

對(duì)于生物學(xué)意義未明或未明確分類的變異（Unclassified variants，UVs）結(jié)果應(yīng)該收集整理，并提倡在同行間交換，為賊終確認(rèn)這些UVs是功能性或非功能性的提供幫助。

對(duì)于不同瘤種的NGS數(shù)據(jù)，可以整合到同一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，這將有助于不同瘤種間變異信息在臨床應(yīng)用中的借鑒。

聲明29：報(bào)告格式和內(nèi)容需要標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)能夠適應(yīng)短期未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)（靶點(diǎn)知識(shí)和檢測(cè)內(nèi)容的變更）。請(qǐng)見(jiàn)附件一，臨床腫瘤NGS的報(bào)告格式。報(bào)告內(nèi)容應(yīng)該包括患者ID、疾病信息、樣本信息、分析技術(shù)信息、主要結(jié)果、結(jié)果解釋、操作員和實(shí)驗(yàn)室專家（腫瘤分子生物學(xué)或遺傳學(xué)專家）簽字等。

聲明30：報(bào)告范圍(reportable range)應(yīng)該根據(jù)測(cè)試目的以及測(cè)序能夠達(dá)到質(zhì)量要求的覆蓋范圍來(lái)決定。例如在對(duì)外顯子組序列的檢測(cè)中，在肺癌中不一定報(bào)告所有覆蓋區(qū)域中檢出的變異。但需知情臨床醫(yī)生本次報(bào)告不能排除潛在的“非關(guān)注區(qū)域”的變異。

聲明31：NGS報(bào)告應(yīng)既簡(jiǎn)明扼要、明確易懂，又能充分提供必要信息以供醫(yī)生參考用于當(dāng)前臨床的靶向治療方案決策。

聲明32：結(jié)果解釋需客觀中肯，平實(shí)地描述腫瘤突變的結(jié)果。在疾病相關(guān)性方面只描述既往研究中的療效或預(yù)測(cè)相關(guān)性，不應(yīng)出現(xiàn)建議使用何種治療手段或策略的文字。檢測(cè)結(jié)果在臨床決策中的應(yīng)用應(yīng)由臨床醫(yī)生或多學(xué)科專家討論決定。

聲明33：遺傳咨詢需多學(xué)科支持，臨床決策的制定過(guò)程中需要與實(shí)驗(yàn)室癌癥遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、病理學(xué)等多方面專家進(jìn)行必要的信息溝通。

7. 知情同意。

聲明34：NGS檢測(cè)項(xiàng)目開(kāi)展前應(yīng)該向患者做好知情同意或相關(guān)遺傳咨詢（genetic counseling），解釋疾病條件下進(jìn)行特定NGS檢測(cè)分析的目的和利弊。同時(shí)需要向醫(yī)生及患者告知測(cè)試的局限性，包括驅(qū)動(dòng)基因的信息、報(bào)告范圍、技術(shù)分析的敏感度和特異度等。

知情同意書(shū)的內(nèi)容至少必須包含：

（1）進(jìn)行基因檢測(cè)的依據(jù)，其中包括醫(yī)學(xué)指南、專家共識(shí)、治療規(guī)范等內(nèi)容，需使患者知悉檢測(cè)的意義和目的；

（2）基因檢測(cè)過(guò)程中可能有的局限性，如提取樣本量是否足夠，樣本質(zhì)量控制指標(biāo)是否適合基因檢測(cè)，如發(fā)生類似情況，需要及時(shí)向患者以及家屬說(shuō)明情況，再?zèng)Q定下一步；

（3）進(jìn)行基因測(cè)序可輔助個(gè)體化治療，但是賊終決定須由臨床醫(yī)生決定；

（4）基因檢測(cè)結(jié)果要只針對(duì)該次送檢樣本；

（5）檢測(cè)機(jī)構(gòu)必須對(duì)患者的身份信息、病例信息以及檢測(cè)結(jié)果等保密?；颊哌M(jìn)行基因檢測(cè)之前需知悉以上事項(xiàng)，并簽署知情同意書(shū)。

8. NGS用于研究與診斷的區(qū)別：

由于技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用單位的能力提升，NGS用于研究或是診斷的界限已經(jīng)模糊，但在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)該明確特定的NGS測(cè)試是用于研究還是診斷。診斷目的的NGS檢測(cè)是為了回答臨床患者腫瘤中是否具有特定的基因變異狀態(tài)（可作用靶點(diǎn)的變異）。診斷檢測(cè)通常是在一個(gè)得到認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。而研究目的的NGS檢測(cè)是研究假設(shè)驅(qū)動(dòng)的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果對(duì)入組患者通常只具有有限或不確定的臨床意義。全外顯子或基因組測(cè)序的診斷結(jié)果由于數(shù)據(jù)量大，除了滿足特定的基因診斷，其他數(shù)據(jù)也可能產(chǎn)生新的研究假設(shè)。

聲明35：研究項(xiàng)目獲得有臨床意義的分子變異結(jié)果需要進(jìn)一步在診斷條件下確證后才可以納入患者的醫(yī)療記錄。

聲明36：研究和診斷的檢測(cè)結(jié)果都應(yīng)該建立數(shù)據(jù)庫(kù)管理，以便于與本地、區(qū)域性的、國(guó)家或國(guó)際的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，這有助于對(duì)變異進(jìn)行臨床分類。

9. CAGC POI項(xiàng)目NGS測(cè)試（Test）的監(jiān)督管理

對(duì)于應(yīng)用于CAGC POI臨床實(shí)踐、試驗(yàn)或研究的NGS檢測(cè)項(xiàng)目，為高效質(zhì)量的同一性和延續(xù)性，將由CSCO CAGC專家組對(duì)所測(cè)試的NGS項(xiàng)目進(jìn)行監(jiān)督管理，管理方式包括現(xiàn)場(chǎng)考察、管理文件和流程監(jiān)督、測(cè)試樣本的室間評(píng)比等。目的是使得參與CAGC POI項(xiàng)目的各個(gè)NGS實(shí)驗(yàn)室能夠達(dá)到統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
 

參考文獻(xiàn)：

[1] Matthijs G, Souche E, Alders M, Corveleyn A, Eck S, Feenstra I, Race V, Sistermans E, Sturm M, Weiss M, Yntema H, Bakker E, Scheffer H, Bauer P. Guidelines for diagnostic next-generation sequencing. Eur J Hum Genet. 2016 Jan;24(1):2-5

[2] Luthra R, Chen H, Roy-Chowdhuri S, Singh RR. Next-Generation Sequencing in Clinical Molecular Diagnostics of Cancer: Advantages and Challenges. Cancers (Basel). 2015 Oct 14;7(4):2023-36

[3] Oliver GR, Hart SN, Klee EW. Bioinformatics for clinical next generation sequencing. Clin Chem. 2015 Jan;61(1):124-35.

[4] Vrijenhoek T, Kraaijeveld K, Elferink M, de Ligt J, Kranendonk E, Santen G, Nijman IJ, Butler D, Claes G, Costessi A, Dorlijn W, van Eyndhoven W, Halley DJ, van den Hout MC, van Hove S, Johansson LF, Jongbloed JD, Kamps R, Kockx CE, de Koning B, Kriek M, Deprez RL, Lunstroo H, Mannens M, Mook OR, Nelen M, Ploem C, Rijnen M, Saris JJ, Sinke R, Sistermans E, van Slegtenhorst M, Sleutels F, van der Stoep N, van Tienhoven M, Vermaat M, Vogel M, Waisfisz Q, Weiss JM, van den Wijngaard A, van Workum W, Ijntema H, van der Zwaag B, van IJcken WF, den Dunnen JT, Veltman JA, Hennekam R, Cuppen E. Next-generation sequencing-based genome diagnostics across clinical genetics centers: implementation choices and their effects. Eur J Hum Genet. 2015 Sep;23(9):1270

[5] Molecular Methods for Clinical Genetics and Oncology Testing; Approved Guideline—Third Edition MM01-A3

[6] Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods; Approved GuidelineMM13-A

[7] Quality Management for Molecular Genetic Testing; Approved Guideline MM20-A

[8] Comparison of immunohistochemistry with fluorescence in situ hybridization in determining the human epidermal growth factor receptor 2 status of breast cancer specimens: a multicenter study of 3 149 Chinese patients. Chin Med J 2014;127 (2): 246-253

[9] Frampton GM, Fichtenholtz A, Otto GA, Wang K, et al. Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing. Nat Biotechnol. 2013 Nov;31(11):1023-31.

[10] 詹啟敏, 曾益新, 王玨, 姬云, 錢海利, 李曉燕, 孫石磊.《腫瘤個(gè)體化治療檢測(cè)技術(shù)指南（試行）》.

[11] 李艷，李金明. 《個(gè)體化醫(yī)療中的臨床分子診斷》 人民衛(wèi)生出版社 2013年8月

[12] NCCN臨床實(shí)踐指南：非小細(xì)胞肺癌（2016.V1）

[13] NCCN臨床實(shí)踐指南：結(jié)直腸癌（2016.V1）

[14] NCCN臨床實(shí)踐指南：乳腺癌（2016.V1）

[15] NCCN臨床實(shí)踐指南：肝癌（2016.V1）

[16] NCCN臨床實(shí)踐指南：胃癌（2016.V1）

[17] NCCN臨床實(shí)踐指南：白血?。?016.V1）

附件：

[1] NGS檢測(cè)報(bào)告格式化模板

[2] 基因名稱及基因突變的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)（NGS技術(shù)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)、NGS數(shù)據(jù)生物信息學(xué)所涉及的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)。中英文對(duì)照）

[3] 臨床腫瘤NGS診斷項(xiàng)目（test）的技術(shù)要求和質(zhì)控

[4] CAGC 2015年度啟動(dòng)會(huì)議紀(jì)要