【佳學(xué)基因檢測(cè)】非小細(xì)胞肺癌生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法或技術(shù)

什么是質(zhì)譜技術(shù)，如何在肺癌基因檢測(cè)中使用？

質(zhì)譜技術(shù)(Mass spectrometry, MS)是一種能夠正確測(cè)定未知樣本中的化合物質(zhì)量的技術(shù)。它基于生成帶電荷的離子,并根據(jù)質(zhì)荷比對(duì)離子進(jìn)行分離和檢測(cè)的原理。

質(zhì)譜技術(shù)在肺癌基因檢測(cè)中的應(yīng)用主要有:

蛋白質(zhì)組學(xué)分析:通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)可以定量檢測(cè)細(xì)胞或血液樣本中的大規(guī)模蛋白表達(dá)譜,尋找與肺癌相關(guān)的蛋白生物標(biāo)志物。

代謝組學(xué)分析:檢測(cè)肺癌細(xì)胞或體液中的代謝物變化,研究代謝路徑的重編程,尋找代謝生物標(biāo)志物。

基因組學(xué)分析:質(zhì)譜技術(shù)可以進(jìn)行DNA和RNA的正確定量,檢測(cè)基因表達(dá)和甲基化水平的變化。

蛋白質(zhì)互作組學(xué):研究蛋白質(zhì)復(fù)合物和相互作用,尋找驅(qū)動(dòng)肺癌發(fā)生的關(guān)鍵蛋白網(wǎng)絡(luò)。

圖像質(zhì)譜:直接在組織切片上進(jìn)行質(zhì)譜分析,研究腫瘤組織的分子表達(dá)模式。

液體活檢:使用質(zhì)譜技術(shù)分析血液循環(huán)腫瘤DNA、外泌體等樣本,實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。

綜上,質(zhì)譜技術(shù)為肺癌提供了多組學(xué)層面的檢測(cè)手段,能提高生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)效率,有助于肺癌的早診早治。未來(lái)質(zhì)譜技術(shù)與其他檢測(cè)技術(shù)的整合,將大大推動(dòng)肺癌正確醫(yī)學(xué)的發(fā)展。 質(zhì)譜技術(shù)允許對(duì)早期非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行非假設(shè)驅(qū)動(dòng)的全蛋白分析,該技術(shù)將目的導(dǎo)向的樣本制備與質(zhì)譜前的液相色譜技術(shù)相結(jié)合。它涉及樣本消化、肽段滴定、電離和生物標(biāo)志物表征等。這些包括優(yōu)化樣本制備流程(MStern印跡、免疫耗竭/濾助樣品制備、懸浮捕獲)、改變質(zhì)譜掃描模式(數(shù)據(jù)依賴采集、數(shù)據(jù)獨(dú)立采集)、開(kāi)發(fā)定量技術(shù)(同位素標(biāo)記/無(wú)標(biāo)記)和改進(jìn)儀器(離子捕獲質(zhì)譜、高場(chǎng)不對(duì)稱離子遷移譜)。使用血液或血清,單次質(zhì)譜運(yùn)行可以表征數(shù)百至數(shù)千個(gè)蛋白?；谫|(zhì)譜的液體活檢已在多種癌癥包括非小細(xì)胞肺癌中進(jìn)行。

proximity擴(kuò)展測(cè)定的原理及其在腫瘤基因檢測(cè)中的應(yīng)用

proximity擴(kuò)展測(cè)定(Proximity extension assay, PEA)是一種蛋白檢測(cè)技術(shù),基于傳統(tǒng)ELISA方法和DNA測(cè)序技術(shù)的原理。

PEA的工作原理是:

使用特異性抗體對(duì)標(biāo)定待測(cè)蛋白?？贵w上連接有互補(bǔ)的DNA序列。

當(dāng)兩個(gè)抗體同時(shí)結(jié)合目標(biāo)蛋白時(shí),相連的DNA鏈發(fā)生靠近,觸發(fā)連接反應(yīng)。

連接后的DNA鏈經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序。

通過(guò)測(cè)序reads數(shù)計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

PEA技術(shù)在腫瘤基因檢測(cè)中的應(yīng)用:

可同時(shí)定量檢測(cè)數(shù)十到數(shù)百種腫瘤相關(guān)蛋白標(biāo)志物。

可用于血液循環(huán)腫瘤DNA等樣本,實(shí)現(xiàn)非入侵性檢測(cè)。

可通過(guò)蛋白組學(xué)檢測(cè)實(shí)現(xiàn)病情監(jiān)測(cè)、藥效評(píng)價(jià)、預(yù)后預(yù)測(cè)等。

結(jié)合腫瘤基因組數(shù)據(jù),可以檢測(cè)驅(qū)動(dòng)基因突變導(dǎo)致的蛋白表達(dá)變化。

可用于研發(fā)與臨床轉(zhuǎn)化,如開(kāi)發(fā)診斷蛋白組學(xué)檢測(cè)試劑盒。

綜上,PEA技術(shù)具有高通量多靶點(diǎn)檢測(cè)優(yōu)勢(shì),為腫瘤正確醫(yī)學(xué)提供了重要的蛋白組學(xué)檢測(cè)手段。

 proximity擴(kuò)展測(cè)定基于傳統(tǒng)夾心ELISA和DNA讀出技術(shù)工作原理。該血清蛋白質(zhì)譜技術(shù)需要極少的樣本量并具有全面的檢測(cè)范圍。特異性抗體對(duì)通過(guò)互補(bǔ)DNA寡核苷酸序列標(biāo)記,允許高保真的差異雜交。所產(chǎn)生的DNA序列經(jīng)擴(kuò)增后進(jìn)行下一代測(cè)序。該先進(jìn)的自我擴(kuò)展測(cè)定法可檢測(cè)3072個(gè)靶點(diǎn),避免了傳統(tǒng)多重免疫分析中的交叉反應(yīng)問(wèn)題。但是,高通量自我擴(kuò)展測(cè)定存在庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序和分析等方面的折衷。
 

反相蛋白質(zhì)數(shù)組與肺癌檢測(cè)

反相蛋白質(zhì)數(shù)組(Reverse phase protein array, RPPA)是一種高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),可用于肺癌的檢測(cè)。

RPPA技術(shù)原理:

1. 轉(zhuǎn)錄組水平:將腫瘤組織/細(xì)胞裂解,提取總蛋白并打印成點(diǎn)陣列。
2. 抗體檢測(cè):使用經(jīng)驗(yàn)證的特異性抗體探針,檢測(cè)點(diǎn)陣列中的蛋白表達(dá)和翻譯后修飾。
3. 信號(hào)檢測(cè):熒光或發(fā)色基質(zhì)反應(yīng)檢測(cè)信號(hào)。
4. 數(shù)據(jù)分析:相對(duì)蛋白表達(dá)水平和修飾情況。

RPPA技術(shù)在肺癌檢測(cè)中的應(yīng)用:

1. 可同時(shí)檢測(cè)數(shù)百種腫瘤相關(guān)蛋白和修飾形式。
2. 可區(qū)分肺癌不同病理類型。
3. 檢測(cè)治療響應(yīng)和預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物。
4. 評(píng)估腫瘤進(jìn)展和藥物耐藥的分子機(jī)制。
5. 優(yōu)于Western blot,維持組織的空間信息。
6. 可用于血清、血漿等體液樣本。
7. 可打印入微陣列進(jìn)行高通量檢測(cè)。

總之,RPPA技術(shù)具備高通量和高特異性的優(yōu)勢(shì),可檢測(cè)包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的關(guān)鍵蛋白標(biāo)志物,有助于疾病的正確化檢測(cè)試劑盒開(kāi)發(fā)、病情監(jiān)測(cè)以及藥物研發(fā)。

反相蛋白質(zhì)數(shù)組是一種高通量靶向的高通量蛋白質(zhì)譜技術(shù),優(yōu)于組織檢測(cè)的蛋白質(zhì)檢測(cè),可檢測(cè)蛋白及其翻譯后修飾。有效變性的蛋白質(zhì)固定于稀釋系列的基質(zhì)上。使用高特異性經(jīng)反相蛋白質(zhì)數(shù)組驗(yàn)證的抗體探針含樣本的切片,并用熒光檢測(cè)或顏色顯影進(jìn)行定量信號(hào)檢測(cè)。利用這種方法可檢測(cè)直徑小于100nm的細(xì)胞外囊泡中的腫瘤蛋白標(biāo)志物,可擴(kuò)展至液體活檢。盡管該技術(shù)需要精細(xì)的工作流程,但已經(jīng)應(yīng)用反相蛋白質(zhì)數(shù)組技術(shù)分析了276種細(xì)胞蛋白,發(fā)現(xiàn)了7種乳腺癌蛋白生物標(biāo)志物。

核酸適體與肺癌正確用藥

核酸適體(Aptamer)是一類可以特異性識(shí)別目標(biāo)分子的短單鏈DNA或RNA。它可以與蛋白質(zhì)、小分子化合物等靶標(biāo)具有高親和力和專一性的結(jié)合,在肺癌正確用藥中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

核酸適體技術(shù)在肺癌正確用藥領(lǐng)域的幾個(gè)應(yīng)用:

1. 識(shí)別和富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞:適體可以特異性捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞,進(jìn)行檢測(cè)和分析。

2. 靶向藥物送遞:通過(guò)與腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)親和的適體,可以特異性向腫瘤細(xì)胞遞送藥物。

3. 聯(lián)合治療策略優(yōu)化:使用適體識(shí)別耐藥相關(guān)分子,指導(dǎo)聯(lián)合用藥策略。

4. 治療反應(yīng)監(jiān)測(cè):設(shè)計(jì)特異性適體探針,評(píng)估治療反應(yīng)和耐藥過(guò)程。

5. 新藥篩選平臺(tái):適體-靶點(diǎn)結(jié)合系統(tǒng)用于verification新藥的靶向性能。

6. 腫瘤成像:使用熒光或放射性標(biāo)記的適體實(shí)現(xiàn)腫瘤的輕射線成像。

總之,核酸適體技術(shù)提供了一系列優(yōu)異的生物探針,其高特異性親和力可廣泛應(yīng)用于肺癌的正確診斷與用藥。適體技術(shù)的進(jìn)一步研發(fā),將大大促進(jìn)肺癌正確醫(yī)學(xué)的進(jìn)步。

核酸適體是可以與靶蛋白高親和力和特異性結(jié)合的短單鏈DNA、RNA或肽。慢解離速率適體掃描測(cè)定使用連接了熒光標(biāo)記物和光裂解連接基的結(jié)合分子,經(jīng)過(guò)生物素 Affinity富集和UV裂解及標(biāo)記后與蛋白質(zhì)復(fù)合。然后蛋白-適體復(fù)合物經(jīng)洗脫,通過(guò)DNA雜交技術(shù)進(jìn)行定量。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了并行超高通量篩選7000多種蛋白質(zhì),但設(shè)計(jì)高質(zhì)量適體用于新靶點(diǎn)的難度仍然存在。

抗原抗體陣列與肺癌正確用藥

抗原抗體陣列技術(shù)利用抗原-抗體特異性結(jié)合原理,可以在固相載體上高通量并行檢測(cè)多個(gè)蛋白質(zhì)標(biāo)志物,在肺癌正確用藥中有廣闊應(yīng)用前景。

抗原抗體陣列技術(shù)在肺癌正確用藥中的幾個(gè)應(yīng)用:

1. 多標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè):實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)十到上百腫瘤相關(guān)蛋白的高通量定量,評(píng)估整體生物標(biāo)志物譜。

2. 正確分子分類:不同細(xì)胞亞群分子表達(dá)模式的差異,有利于細(xì)胞功能狀態(tài)正確判斷。

3. 藥效預(yù)測(cè):檢測(cè)關(guān)鍵通路/過(guò)程的蛋白表達(dá)變化,評(píng)價(jià)靶向藥物療效。

4. 耐藥機(jī)制研究:比較敏感性和耐藥腫瘤的差異蛋白表達(dá),解析獲得性耐藥機(jī)制。

5. 個(gè)體化用藥選擇:指導(dǎo)藥物的正確應(yīng)用,實(shí)現(xiàn)藥物-患者匹配。

6. 藥效動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè):不同給藥時(shí)間點(diǎn)收集標(biāo)本,監(jiān)測(cè)藥物作用過(guò)程。

7. 新藥開(kāi)發(fā)平臺(tái):評(píng)價(jià)新藥分子的作用方式和適應(yīng)證。

8. 臨床試驗(yàn)支撐:蛋白組學(xué)分析驗(yàn)證新藥臨床前后效應(yīng)。

綜上,抗原抗體陣列技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌正確診斷和用藥的多維度支持,推動(dòng)肺癌正確醫(yī)學(xué)實(shí)踐。 基于夾心ELISA和磁珠的陣列僅限于中低通量蛋白質(zhì)譜分析。抗原抗體陣列因其在分析和生化特性上的相似性,采用平面和磁珠抗體陣列以及蛋白質(zhì)組陣列。它通過(guò)親和力結(jié)合、共價(jià)結(jié)合和物理吸附等方式將特定抗體固定在基質(zhì)上。該方法穩(wěn)定性強(qiáng),可以表征成千上萬(wàn)種蛋白,賊小化免疫反應(yīng)混合液中抗體誘導(dǎo)的免疫原性交叉反應(yīng)?？贵w陣列具有超高靈敏度,可以克服非靶向蛋白引起的交叉敏感問(wèn)題。理論上,抗原陣列可以檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、細(xì)胞、小分子、脂質(zhì)、抗體和核酸的相互作用。迄今為止,賊全面的人源蛋白質(zhì)組陣列可檢測(cè)21000多種蛋白形式(覆蓋超過(guò)81%的蛋白質(zhì)組),使其成為強(qiáng)大的工具。此外,高通量蛋白質(zhì)陣列被用來(lái)設(shè)計(jì)一組針對(duì)H-RAS、P53和ETHE1的早期肺癌診斷自身抗體組合診斷面板。