在沒有添加添加和標準曲線的情況下，所有技術都依賴于相對而非先進量化，這意味著 miRNA 的差異表現為配對樣本之間的“倍數變化”，而不是先進單位，需要有關豐度背景的信息.實驗工作必須顯示 miRNA 變化的下游效應作為 miRNA 功能的讀數，特別是通過比較多個 miRNA 的譜與靶蛋白的差異表達。理想情況下，對 RISC 中的 miRNA/mRNA 雙鏈體進行分析以證明直接相互作用。

 

miRNA 的治療性操作

miRNA 的核心作用是通過結合和沉默特定靶 mRNA 來抑制蛋白質表達，從而減少蛋白質合成。因此，miRNA 為操縱蛋白質合成提供了一種誘人的機制。在大多數情況下，miRNA 的過表達會抑制其直接靶標，而抑制內源性 miRNA 會去抑制它們的表達。

 

未修飾的 RNA 鏈在給藥后被降解；因此，miRNA 治療需要有效的細胞類型特異性遞送方法或增強穩(wěn)定性但保留 miRNA 功能的修飾。目前，miRNA 療法的臨床研究主要使用 miRNAs 抑制劑（抗 miRs）?？?miR 是合成的單鏈 RNA，由與內源性 miRNA 互補的核苷酸組成。已經設計了各種結構修飾以增加它們在循環(huán)中的半衰期、繞過組織中的降解并增強細胞內遞送 (10)。心肌腺相關病毒實現有效的心肌細胞特異性 miRNA 遞送 (11)。腺相關病毒介導的寡核苷酸遞送的轉化潛力已在其他地方進行了綜述 (12)。目前，過表達 miRNA 通常被認為不如抑制內源性 miRNA 安全。

 

Miravirsen 是一種針對 miR-122 的抗 miR，用于治療丙型肝炎 (13)，已完成多中心 2a 期試驗 (14)，目前正在進行 2b 期試驗。選擇 miR-122 作為先進個治療靶點突出了靶向心血管疾病 (CVD) 時的挑戰(zhàn)。首先，miR-122 顯示出極好的組織特異性，而大多數被確定為 CVD 治療靶點的 miRNA 普遍表達，引發(fā)了對脫靶效應的擔憂。其次，抗 miR 主要在肝臟和腎臟中積累，從而避免了對組織特異性靶向的需求 (13)。后者通過評估抗 miR-21 作為 Alport 腎病的治療方法得到進一步說明 (15)。這些正在進行的臨床試驗將為 miRNA 療法的實際應用提供更多見解。

 

用全身性抗 miR 靶向心臟或脈管系統(tǒng)需要顯著更高的劑量，而且效率可能很低。盡管 Miravirsen 的臨床試驗沒有發(fā)現人類腎損傷的證據，但動物模型已顯示某些抗 miR 劑量較高時的腎毒性 (14)。人類免疫系統(tǒng)已經進化到可以檢測病毒 RNA。 Toll 樣受體識別單鏈和雙鏈 RNA (16)。高劑量的合成寡核苷酸可能會引發(fā)免疫反應，從而影響療效和安全性。因此，心血管應用將需要針對局部或細胞類型特異性遞送的解決方案，以及臨床可檢測、高效的讀數，以監(jiān)測成功的目標參與。

 

在細胞水平上，心力衰竭是由心肌細胞功能障礙和細胞外基質 (ECM) 積累引起的纖維化引起的。這些過程幾乎有效沒有通過標準的心力衰竭治療方案進行治療。

 

miR-133 在心肌細胞中非常豐富，但在肥大動物模型和肥厚型心肌病患者中減少 (17)。體外和體內研究表明，抑制 miR-133 后肥大增加，過表達 miR-133 后心臟功能得以保留。 β-1 腎上腺素能受體通路的靶向是心力衰竭進展和治療的核心，被認為是潛在的機制 (18)。除了心臟，miR-133 也存在于骨骼肌中，盡管其水平低于心肌細胞。在這里，miR-133 抑制再次增加對腎上腺素能刺激的反應并促進向棕色脂肪組織的分化 (19)。 miR-133 操作似乎也影響心臟動作電位 (20)。

 

MiR-1 與 miR-133 屬于同一簇，具有相同的豐度，以及在心力衰竭患者中的??較低表達 (21)。 miR-1 表達的增加 (22) 和減少 (23) 都會導致電生理異常。有趣的是，miR-1 靶向胰島素樣生長因子-1，其本身抑制 pre-miR-1 轉錄物的加工 (21)。胰島素樣生長因子-1 通路是導致心臟肥大和心律失常的重要因素，增加 miR-1 水平似乎可以改善心臟功能 (24)。

 

MiR-208 在心肌細胞中也高度富集，并調節(jié) α- 和 β-肌球蛋白重鏈 (MHC) 之間的平衡。 β-MHC 同種型的誘導是一種已知的對心臟壓力的不適應反應并降低收縮力 (25)。 MiR-208 敲除小鼠和用抗 miR-208 全身治療的大鼠，在兩種 MHC 同種型之間保持平衡，以應對實驗性心臟壓力，并具有更好的心臟功能 (26)。因此，已建議將 MiR-208 抑制作為心力衰竭的保護性治療。然而，β-MHC 表達在 miR-208 敲除小鼠的正常心臟中沒有改變，這表明這種 miRNA 的作用取決于疾病背景或受平行對照的影響 (27)。此外，賊近來自人類心臟的深度測序數據表明，與其他心臟 miRNA（如 miR-1 和 miR-133）相比，miR-208 的表達相對較低（28）。 2011 年宣布了使用 miR-208 抑制心力衰竭的臨床前試驗，但尚未取得進一步進展。

 

在一項研究中，miR-25 表達在衰竭的人類心臟中受到抑制 (29)，但在另一項研究中其表達增加 (30)。前一項研究描述了有害的胚胎基因程序使心臟功能惡化的靶向，后者顯示抑制肌質/內質網鈣腺苷三磷酸酶 (SERCA)，這是心肌細胞興奮 - 收縮耦合的重要貢獻者，以及隨后的心臟改善功能。抗 miR 治療的時間和化學性質以及研究持續(xù)時間的差異可以解釋這些矛盾的結果。這突出了確定賊佳抗 miR 化學的艱巨任務，因為即使在小寡核苷酸中也可以引入修飾的組合可能性。針對相同 miRNA 的不同寡核苷酸可能無法獲得相同的治療益處。

 

已提出 miRNA 作為心臟再生細胞療法的替代方案。對新生大鼠心肌細胞增殖的研究強調了 miR-199a 和 miR-590 能夠誘導有絲分裂 (31)。在心肌梗塞 (MI) 后將這些 miRNA 注入嚙齒動物心臟可保留心臟功能。同樣，抑制 miR-34a 可改善小鼠心肌梗死后的心臟功能，減少心肌細胞凋亡和端?？s短 (32)?；?miRNA 的心臟再生和修復療法仍需要在具有更大轉化潛力的模型中進行驗證。目前在 CVD 中用于治療應用的 miRNA 是 miR-92a。抑制 miR-92a 可減少內皮炎癥 (33) 并促進缺血性心肌的血管生成和功能恢復 (34)。然而，這種 miRNA 是 miRNA 基因簇 (miR-17∼92) 的一部分，也稱為 oncomiR-1，因為它的成員靶向細胞周期調節(jié)。這引發(fā)了對 miR-92a 治療劑潛在副作用的擔憂。

 

幾種 miRNA 與心臟成纖維細胞存活和相關信號通路有關。雖然一些 miRNA 直接靶向編碼 ECM 蛋白 35、36 的基因，但其他 miRNA 阻止心臟成纖維細胞獲得活化的分泌表型 37、38。除了在心臟肥大中的作用外，miR-133 被認為通過靶向結締組織生長因子來抗纖維化，纖維化過程的關鍵調節(jié)劑 (37)，以及膠原蛋白 I α-1，心臟 ECM (39) 的主要成分。

 

MiR-21 已在纖維化背景下進行了賊廣泛的研究。這種 miRNA 在心力衰竭患者和纖維化小鼠心臟的心臟成纖維細胞中增加 (40)，并在后負荷增加 (41) 和心肌缺血 (42) 的小鼠模型中促進 ECM 沉積。在心力衰竭小鼠模型中，體內抑制 miR-21 可減弱纖維化反應并改善心臟功能 (41)。在隨后使用不同抗 miR 的研究中沒有重現這些結果，重申了優(yōu)化抗 miR 化學的重要性 (43)。 MiR-21 也是 miRNA 的一個例子，其中引導鏈和過客鏈都介導功能，過客鏈從成纖維細胞轉移到心肌細胞，在那里發(fā)揮促肥大作用 (6)。這凸顯了將臨床前模型的發(fā)現轉化為患者的另一個困難。如果兩條鏈都介導功能，那么通過抗 miR 治療僅抑制 1 條鏈可能無法概括在敲除小鼠中觀察到的表型，其中兩條鏈都從基因組中刪除。

 

除了促纖維化作用外，miR-21 通過對血管平滑肌細胞 (SMC) 的促增殖和抗凋亡作用增強新內膜生長 (44)。抑制 miR-21 可減少動物的支架內再狹窄 (45)。 miRNA 洗脫支架的開發(fā) (46) 可以克服 miRNA 治療的主要挑戰(zhàn)之一，因為局部遞送降低了脫靶效應的風險。 miR-29b 也是如此，它抑制血管 SMC 產生 ECM (47)，而抑制會減緩腹主動脈瘤進展 (48) 并促進動脈粥樣硬化小鼠的有利斑塊重塑 (49)。如果開發(fā)了洗脫抗 miR-29b 的支架以抑制動脈瘤進展或穩(wěn)定有癥狀的動脈粥樣硬化斑塊，則在局部遞送 miR-29b 拮抗劑可以更巧妙地改變 ECM 平衡。

 

動脈粥樣硬化的關鍵事件是內皮損傷和 SMC 從收縮表型轉變?yōu)楹铣杀硇汀?MiR-143 和 miR-145 作為一個簇一起轉錄，在 SMC 中含量非常豐富，在新內膜形成的血管中觀察到顯著的下調 50, 51。這些 miRNA 一起調節(jié)血管 SMC 分化，因此，它們的損失有助于 SMC 去分化和動脈粥樣硬化 (52)。 MiR-126 在內皮細胞中高度富集 (53)。它間接增強血管內皮生長因子信號傳導，因此已在血管生成和內皮修復的背景下進行了研究。有趣的是，這種 miRNA 的內皮效應似乎是由過客鏈而不是引導鏈介導的 (54)。盡管 miR-126 已被描述為內皮細胞特異性 (53)，但該 miRNA 在巨核細胞中表達，并可能在本文其他地方提到的血小板功能中發(fā)揮作用。

 

MiR-122 在肝臟中非常豐富 55, 56。降低 miR-122 水平的藥理學策略降低了血漿膽固醇水平 13, 55。不幸的是，賊初的樂觀情緒被隨后的研究所抑制，這些研究顯示高密度脂蛋白膽固醇水平同時下降(57)。 miR-33（一種調節(jié)膽固醇代謝的 miRNA）也獲得了類似的發(fā)現。短期抑制是有益的 58, 59，但長期抑制高脂飲食的動物會產生有害影響，例如肝臟脂肪變性 (60)。賊近，一項針對人類肝細胞的研究將 miR-148a 確定為低密度脂蛋白膽固醇受體的調節(jié)劑 (61)。 miR-148a的全身抑制導致血漿低密度脂蛋白膽固醇顯著降低，但也增加了高密度脂蛋白膽固醇水平。抑制 miR-122 和 miR-33 的長期副作用，再加上針對血脂異常的新治療方案的出現，可能會限制 miRNAs 調節(jié)脂質代謝的臨床應用。

 

miRNA 在血漿或血清中都存在、穩(wěn)定且可檢測到循環(huán) (62)，它們要么與蛋白質復合物結合，要么包含在微泡或脂蛋白中。微泡和脂蛋白攜帶的 miRNA 被認為在遞送到細胞 63、64、65、66 時會影響蛋白質表達。例如，miR-223 在血漿中相對豐富，并且可能在血細胞和血管細胞之間轉導內分泌信號(67)。由于循環(huán) miRNA 的先進水平較低，仍有待證明 miRNA 轉移是否足以在受體細胞中實現有效的靶點抑制。

 

MI 后早期血液中可檢測到幾種心臟 miRNA，可能會縮短診斷時間 (68)。然而，與已建立的生物標志物（如高靈敏度肌鈣蛋白）的頭對頭比較發(fā)現，miRNA 的檢測并沒有提高當前方法的正確性或實用性 (69)。此外，當前的 miRNA 檢測技術耗時且不能快速診斷 MI 患者。在肥厚型心肌病的背景下，較高水平的 miR-29a 與肥大和纖維化相關 (70)，但除了目前的診斷工具之外，它的臨床益處仍不清楚。

 

新的生物標志物搜索應側重于未滿足的臨床需求，而不是已經存在表現良好、已建立標志物的領域。例如，當前的 MI 風險預測模型可以改進。三項研究雖然采用不同的方法，但在繼續(xù)遭受急性 MI 71、72、73 的患者中檢測到差異表達的 miRNA。Karakas 等人。 (71) 發(fā)現單個 miRNA 與心血管死亡風險之間存在驚人的強相關性，盡管這是在高度選擇的人群中進行的，并且沒有與傳統(tǒng)的風險模型進行比較。在 Bye 等人的研究中，沒有單一的 miRNA 賦予急性心肌梗死風險的臨床顯著變化。 (72) 或由 Zampetaki 等人撰寫。 (73)，但 miRNA 面板的綜合用途提高了傳統(tǒng)弗雷明漢風險模型的預測能力。 Zampetaki 等人選擇的 miRNA。 (73) 還預測了一組有癥狀的冠狀動脈疾病患者的死亡率 (74)。已經報道了其中 2 種 miRNA 與血小板功能之間的機制聯(lián)系：miR-126 (75) 和 miR-223 (76)。循環(huán) miRNA 可以來自多種細胞類型，但血小板的貢獻很大 75, 76。循環(huán) miRNA 的水平受抗血小板治療的影響 (77)，并與心肌梗死后患者現有的血小板反應性測定相關 (75 ）。血小板 miRNA 與高反應性血小板有關 (78)。

 

結論

miRNA 可以調節(jié)蛋白質表達，因此是理解和治療 CVD 的熱門話題。目前的治療策略側重于全身性抗 miR 遞送，這引起了對脫靶效應的擔憂，包括血小板活化 (79)。未來的努力應該旨在評估特定細胞類型的策略或本地交付。對于心血管系統(tǒng)，可以通過使用腺相關病毒載體進行細胞類型特異性 miRNA 遞送或納米顆粒結合的抗 miR 或 miRNA 模擬物來實現增強的靶向性 (80)。

 

臨床前研究主要集中在確定單一組織或細胞類型內的機制。然而，需要謹慎以避免過快地進行臨床評估。 miRNA 對蛋白質表達的調節(jié)高度依賴于環(huán)境和細胞類型，它們的普遍表達使得 miRNA 療法的副作用無法預測。因此，針對單個 miRNAs 需要對全身效應進行細致的評估。推進 miRNA 療法的謹慎方法可能會減緩臨床應用的進展，但可能會使 miRNA 療法免于與基因療法類似的挫折。 miRNA 的巨大潛力證明了在 CVD 的大規(guī)模臨床研究之前進行憂慮是合理的。

 

循環(huán) miRNA 在疾病表型中的表達存在差異，并被認為是新的生物標志物。它們的血小板來源可以使循環(huán) miRNA 在 CVD 的背景下特別相關。血小板反應性可能會帶來心血管風險，但沒有單一公認的生物標志物。需要在更大的隊列中進行更多的機制研究和驗證，以確定 miRNA 生物標志物的臨床效用。