【佳學基因檢測】臨床分子病理實驗室二代基因測序檢測專家共識

病理分析水平與機構要求的理解

臨床分子病理是病理科的一個分支學科，由佳學基因等第三方臨床醫(yī)學實驗室出具的基因解碼、高水平的基因檢測的報告是疾病病理分析先進水平。在國際上這一業(yè)務由醫(yī)學檢驗實驗室承擔具有其必然性和可行性，同時也是對病理分析水平的一種高效。但是醫(yī)學檢驗實驗室只有遵循專家共識，并在此基礎上進一步發(fā)展，才會在腫瘤及遺傳病的診斷和治療上發(fā)揮這一高新技術應有的作用。佳學基因積極支持、并遵循這一國家層面上的行業(yè)標準。

《臨床分子病理實驗室二代基因測序檢測專家共識》編寫組

近年二代基因測序（next-generation sequncing，NGS）技術快速發(fā)展，其應用已進展至臨床檢測，如遺傳疾病、實體腫瘤、血液腫瘤、感染性疾病、人類白細胞抗原分析及非侵襲性產前篩查等。 國內外有關學會已出臺相關共識與指南以推動其在臨床中的應用[1-4]。 中華醫(yī)學會病理學分會和中國抗癌協會腫瘤病理專業(yè)委員會前期組織病理、臨床、生物信息等專家進行了充分討論，擬在NGS的操作流程、數據處理、結果解讀等方面作規(guī)范和建議，以規(guī)范NGS在分子病理領域的應用。

臨床分子病理實驗室NGS樣本可采用甲醛固定石蠟包埋（ formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）組織、新鮮組織、各種體液及其上清液、體液離心細胞蠟塊、血漿/血液標本等。 本共識特色是基于病理評估的組織樣本（FFPE組織、新鮮組織）而形成的規(guī)范。 測序分析范圍基于目前臨床需求，本共識著重于目標區(qū)域測序（panel）分析的實踐。 隨著技術的更新和應用的成熟，本共識將持續(xù)更新以滿足臨床需求。

一、實驗室總體要求

NGS檢測實驗室的總體設計與要求應參考《分子病理診斷實驗室建設指南（試行）》、《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》、《個體化醫(yī)學檢測質量高效指南》、《腫瘤個體化治療檢測技術指南》、《個體化醫(yī)學檢測實驗室管理辦法》、《測序技術的個體化醫(yī)學檢測應用技術指南（試行）》進行[5-7]。

1. NGS檢測人員的資質要求：NGS檢測技術人員應具備臨床病理學、分子生物學的相關專業(yè)大專以上學歷，并經過NGS技術的理論與技能培訓合格，同時具有臨檢中心《臨床基因擴增實驗室技術人員培訓合格證》。 數據分析人員應具有臨床醫(yī)學、分子生物學或遺傳學知識背景并經生物信息學培訓。 賊終報告應由中級或碩士以上具有病理學背景、經培訓合格的本單位執(zhí)業(yè)醫(yī)師或者授權簽字人（高級職稱或醫(yī)學博士學位）審核。
2. NGS檢測實驗室的區(qū)域設置要求：原則上NGS實驗室應當有以下區(qū)分：樣本前處理區(qū)、試劑存儲和準備區(qū)、樣本制備區(qū)、文庫制備區(qū)、雜交捕獲區(qū)/多重PCR區(qū)域（先進擴增區(qū)）、文庫擴增區(qū)（第二擴增區(qū)）、文庫檢測與質控區(qū)、測序區(qū)、數據存貯區(qū)。各工作區(qū)空氣及人員流向需要嚴格按照《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》配置。分區(qū)可根據實際情況合并，但是在前處理和建庫時，血液樣本與組織樣本分開。
3. NGS檢測試劑及項目要求：試劑和測序平臺應選擇中國食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）承認產品。 涉及實驗室自配試劑，應該有嚴格的試劑制備標準操作規(guī)程（SOP），需經過臨床實驗室自建項目（LDT）驗證合格才可使用。 每個NGS檢測項目在驗證時需要根據建庫方法、測序平臺和分析工具以及不同的突變類型，包括單堿基突變（single nucleotide variant，SNV）、小片段插入或者缺失（Indel）、基因拷貝數變異（copy number variations，CNV）、染色體結構變異（structural variation，SV）以及不同的樣本類型（如FFPE組織、新鮮組織、全血、胸水等）對特定panel的正確性、正確性、敏感性、特異性等性能參數進行 LDT驗證。 應該有經過標準品測試的在不同的變異頻率（mutant allele frequencies，MAF）下，不同測序深度的靈敏度及特異度數據，確定不同樣本的可信的測序深度。 經驗證后，SOP發(fā)生的任何改動，包括試劑、儀器、基因項目等都需要重新做驗證。 驗證實驗結果簽名留底備案。
4. NGS檢測實驗室的質量管理要求：NGS檢測主要包括實驗操作和生物信息學分析兩部分。 實驗操作部分包括樣本準備、文庫制備、 編碼（barcoding）、目標區(qū)域富集、測序等；生物信息學分析部分包括定位（mapping）、比對、變異識別、變異注釋、變異解讀及報告等。 上述流程均需要建立實驗室質量管理體系文件和SOP及機器運行和維護SOP，具有嚴格的室內質控措施；定期參加室間質評以及有持續(xù)的質量高效和改進計劃。

二、NGS分析樣本、基因panel和轉運要求

NGS分析樣本類型可采用FFPE組織、新鮮組織、各種體液及其上清液、體液離心細胞蠟塊和血漿/血液標本等。
對于腫瘤體細胞變異初次NGS檢測應先進經病理評估的組織樣本，在此數據基礎上的再次檢測可選取液體樣本動態(tài)監(jiān)測。
NGS檢測前需通過病理診斷明確其腫瘤的性質及含量，根據不同腫瘤類型選擇合適的基因panel測序[8-11] 。
不同疾病的基因panel列表，必須由臨床與檢測機構的專家共同決定，在滿足臨床需求的同時達到賊優(yōu)化的實驗設計。
未經病理評估的基因檢測結果不可單獨用于分子病理臨床診斷目的。
樣本質量對檢測結果和分析至關重要，病理醫(yī)師需要對可評估的樣本進一步明確病理診斷，并評價標本有無出血、壞死和不利于核酸檢測的前處理（例如含HCI脫鈣液處理），病變細胞（如腫瘤細胞）的總量和比例，避免假陰性。 組織標本中腫瘤細胞含量建議達到20%以上， 低于此標準可富集后檢測[12]。
NGS檢測實驗室應對不同類型的樣本有采集及處理SOP指導。 對于不同的樣本(FFPE組織、體液、血液等）實驗室應有不同的樣本運送SOP，物流環(huán)節(jié)（含冷鏈運輸）應有相關運送記錄，確保樣本運送安全、無污染、無降解。
 

三、NGS檢測流程中的質量標準

1. 核酸提取及其質量分析：提取的核酸質量是NGS檢測成功的關鍵因素，在制備文庫前應采用多種方法對核酸質量評估，包括純度、濃度和完整性分析。需要根據不同的樣本類型制定相應的SOP用以鑒定核酸的純度、濃度、完整性或降解程度等。 對應明確接受和拒絕的標準。
2. 文庫制備及其質量分析：文庫制備方法主要有雜交捕獲和擴增子建庫，無論采用何種方法制備文庫和平臺檢測，都應對檢測基因、區(qū)域或突變熱點進行描述，并建立實驗室檢測SOP。 建立好文庫后上機測序前需對文庫進行質量分析。 每個檢測項目應設定其文庫質量的要求，明確接受或拒絕的標準。
3. NGS測序 儀上機檢測及其質量分析：測序主要有檢測氫離子釋放和熒光信號兩大技術平臺。 測序時根據檢測樣本量和質量要求確定適當的芯片，以高效測序質量和靶區(qū)覆蓋深度。 錄入樣本編號、檢測內容、設定參數等信息，按儀器操作流程進行測序。 產生的測序數據質量參數要求詳見后文。
4. NGS檢測中的樣本追蹤及對照設置：（1）樣本追蹤：為確保檢測過程中樣本沒有混淆或污染，可選用多個SNV位點或其他標簽作為樣本身份標識（sample ID），在檢測前對每個樣本進行SNV位點信息的測定，在NGS檢測后對上述位點進行追蹤，證明沒有交叉污染。 （2）陽性對照：應用組合型質控材料，可采用已知突變信息的混合樣本，以模擬樣本的復雜性。 實驗時同時檢測，以確保其檢出能力。（3）陰性對照：用無核酸或明確無突變的樣本作為模板同時進行檢測，以確保檢測過程中沒有污染或非特異性。 （4）應對方案和替代方法：各個質量控制步驟中如出現異?；蚴?，實驗室應有應對措施或備選方案；對于測序結果質量差或有問題的區(qū)域應建立替代方法（如Sanger測序）。

四、生物信息分析

NGS數據的生物信息分析可分為兩個主要步驟：一是對測序數據進行質控分析及過濾。 二是對通過質控的序列進行變異位點鑒定分析并注釋。 所用各種生物信息分析軟件，都要通過適量標準品測序數據進行驗證，證明所用軟件及參數可達到臨床報告的要求。

1. NGS 生物信息分析流程標準：（1）質控分析：為高效分析結果的高效性，需要對原始的測序數據進行質量控制與過濾。 測序數據的質量控制主要包含4個方面：質量評估、去接頭序列、去低質量序列、去重復序列。 （2）序列比對：將通過質控后每一條read 與參考基因組進行比對，回貼到基因組上賊佳位置。（3）變異鑒定：對每個位點進行變異鑒定。在腫瘤 panel 測序中，主要檢測SNV和Indel兩種突變類型，參數調整后可分析CNV。 部分panel的設計還可以鑒定染色體易位。 對于腫瘤panel基因測序數據，鑒定后的變異位點都需要進行該位點可視化查看和確認，如The Integrative Genomics Viewer（IGV）。（4）變異注釋：基于通用數據庫，對突變基因位點進行功能注釋，詳見下文。
2. NGS生物信息分析流程質量管理：實驗室應建立生物信息學程序（Pipeline）的書面質量管理計劃文件。 必須包含每次運行時監(jiān)測和評估運行性能的指標和質控參數，以及定期（例如每月、每季度）監(jiān)測的指標和質控參數。 指標和質控參數可包括但不限于標準品的突變類型及百分比。 生物信息分析流程建立后，需要采用已知變異類型和變異頻率的標準品進行驗證，驗證其特異度和靈敏度是否達到實驗室要求。 驗證結果簽名留底備案。 （1）NGS 數據存儲：實驗室需要在生物信息分析過程中對原始數據及賊后的結果數據進行標準化存儲，并要保存相應的年限以備檢查。 （2）版本可追溯性：每份病例數據分析報告中，生物信息數據分析流程所涉及軟件、算法、參數及數據庫的版本必須可溯源。 （3）異常記錄：實驗室需要建立一個異常記錄文檔，用來記錄偏離NGS生物信息分析標準分析流程的檢測。
3. NGS生物信息分析質量指標：原始文件及比對結果文件的質量指標見表1。
   表1 原始文件及比對結果文件的質量指標含義

    

   參數	指標含義
   單堿基質量	評估read中每個堿基的質量分數
   堿基質量中位數	每條read末端堿基質量明顯下降，堿基質量中位數是衡量這段 read的重要指標
   重復read的百分比	重復read 的百分比是文庫復雜度的指示值
   包含接頭序列的read 數量	包含接頭序列的read總數
   回貼read的百分比	回貼到參考基因的read百分比
   目標區(qū)域read百分比	回貼到目標區(qū)域的read百分比
   目標區(qū)域的平均深度	目標區(qū)域的平均測序深度
   目標區(qū)域測序均一度	目標區(qū)域被覆蓋到的一致性

4. NGS數據存儲格式標準：為了規(guī)范和管理各類數據，各個實驗室需按照編號進行數據管理，所有數據按照國際標準格式進行存儲。 必須建立本地變異數據庫（用于檢驗變異真實性）。
5. NGS數據存儲傳輸及共享安全標準：實驗室需要制定規(guī)章制度以確認測序數據在內部、外部存儲及傳輸過程中的安全性和機密性。 正常人群的變異數據應該共享。

五、NGS結果解釋及報告

1. NGS 臨床報告包含內容：基于高通量測序技術，臨床實驗室比較容易獲取更高通量的臨床樣本檢測數據，不可避免會檢測到意義未知的變異位點，
   在實際工作中會有一定的不確定性。 但NGS的檢測報告建議體現以下內容：
   （１）檢測名稱，如XXX基因變異檢測報告。
   （２）患者基本信息：姓名，年齡，性別，住院號，送樣醫(yī)院科室及醫(yī)師等。
   （３） 樣本信息：病理號，取材部位，樣本類型（FFPE組織、新鮮組織、血液等）、送檢日期、報告日期等。
   （４）病理信息：腫瘤組織類型、位置、TNM分期、細胞含量、腫瘤細胞比例、特殊說明（出血、壞死、酸脫鈣處理等）。
   （５）檢測技術：包含所用基因panel、檢測平臺名稱，分析軟件版本號等。
   （６）結果列表應包含：基因名稱、變異在染色體位置、變異頻率、cDNA 的Genbank 號（NM 開頭）及符合人類基因組變異協會（Human Genome Variation Society ，HGVS）書寫規(guī)范的突變類型、 編碼蛋 白Genbank 號 （NP開頭） 及突變類型、雜合/純合狀態(tài)等。
   （７）臨床意義解讀和批注：體細胞突變，報告各個腫瘤檢測到的變異位點及臨床意義。 胚系突變，對于檢測到的變異位點的致病性予以相應的臨床解釋。 臨床意義解讀要客觀平實的描述，對于疾病相關性只描述既往研究中的療效或預測，不能出現使用何種治療手段或策略的語言。
   （８）若檢測失敗，應闡述失敗原因。
   （９）賊終報告應由檢測者、報告醫(yī)師或指定審核人聯合簽發(fā)。
2.  基因變異的命名：在描述所檢測出的基因變異時要遵循一定的原則和規(guī)范，推薦使用人類基因組變異協會命名指南（www.hgvs.org）。對于遺傳病相關基因變異命名，推薦美國醫(yī)學遺傳學學院（American College of Medical Genetics and Genomics; https://www.acmg.net）的遺傳疾病變異分類指導的命名、遺傳背景說明以及權威文獻說明。
3. 臨床意義的解讀和批注：對于腫瘤體細胞突變，根據突變的類型和已有的報道及指南，基因變異提倡分級的處理方式。
   A級：美國食品藥品管理局（FDA）或CFDA批準的用藥治療靶點；寫入中外診療指南有明確診斷/治療/預后意義的變異。 在報告中注釋該變異位點的臨床診斷/治療/預后意義的權威指南來源。B級：尚未進入診療指南，但已經寫入該領域的專家共識的變異位點。 注釋時要批注研究報道及專家共識的來源，明確其藥物及其臨床意義、正在開展的狀態(tài)等信息。
   C級：FDA或CFDA 批準用于其他腫瘤可預測療效的基因變異，或者正在進行中的臨床試驗變異位點。 注釋時要批注用于其他腫瘤的權威指南，研究文獻及臨床試驗正在開展的狀態(tài)等信息。
   D級：處于學術爭議或臨床意義不明確的基因變異。 同一實驗室應該有統(tǒng)一的政策用來應對檢測過程中出現的臨床意義不明變異情況［４］ 。
   對于以上幾種情況在報告的時候注意客觀平實地描述檢測的結果，在病理報告中不能出現建議使用何種治療手段或策略的語言。
   對于胚系突變（germline mutation）檢測，除了中外診療指南及重要參考文獻以外，推薦兩個數據庫：Online Mendelian Inheritance in Man（http：//omim.org/）和美國醫(yī)學遺傳學學院（https://www.acmg.net）的遺傳疾病變異分類指導注釋臨床意義，并附上數據庫和參考文獻內容。遺傳注釋還可以參考各亞專科的專業(yè)數據庫進行注釋（比如乳腺癌BRCA1/2基因等）。
4. 意義不明位點的處理：由于通量的增加和人種差異，臨床腫瘤樣本可能發(fā)現新的變異位點。 實驗室必須制定相關政策方案用來應對檢測過程中出現的臨床意義不明變異情況。 政策可以是一發(fā)現變異就報告，但附上說明和意義。 也可以是不報告這些發(fā)現或只報告小部分變異結果，并附上說明和參考文獻及數據庫。 但是在報告的備注里一定要聲明本實驗室的報告規(guī)則。
5. 知情同意：建議提供患者手寫或在線版的知情書。