【佳學基因檢測】極微量（單細胞擴增）基因檢測程序及步驟

試劑來源：

佳學基因致力于從多種來源的DNA樣品中正確測定人體的基因序列變化，并對這些變化的生命密碼進行解讀和分析。是先進基因信息檢測及解碼技術的供應者，提供各種樣本純化和分析的方法和產品。先進的、高質量的產品和服務確保了從樣本獲得分析結果。

技術優(yōu)勢

對單個細胞或有限的樣本進行高度均一的全基因組擴增（WGA）

采用多重置換擴增技術對基因組位點進行無偏差的擴增

適用于二代測序等新技術應用

產量穩(wěn)定，可達40 µg（產物平均長度大于>10 kb）

可用于癌癥、干細胞或宏觀基因組學（metagenomics）研究

很多研究人員使用二代測序儀器對生物樣本的DNA序列進行分析和基因分型，但經常受限于有限的樣本量。佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術可均一的擴增單個細胞（1至1000個細菌或腫瘤細胞）或純化的基因組DNA，能夠覆蓋基因組所有位點。另有專用于干血或新鮮或冷凍的組織樣本的實驗方案。所有緩沖液和試劑生產都經過嚴格控制的流程，避免污染DNA，確保每次實驗獲得高效的結果。該產品采用多重置換擴增（MDA）技術，對所有基因組位點進行無偏差的擴增。與基于PCR的全基因組擴增技術相比，該技術具有更好的擴增高保真度，避免出現假陽性或假陰性信號。

Performance

覆蓋基因組所有位點，十分適用于二代測序和其他下游應用

佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術擴增的DNA平均長度大于10 kb，并且覆蓋所有基因組位點。該產品已經過驗證，適用于二代測序、基于芯片技術的比較基因組雜交（aCGH）和real-time PCR應用等多種下游分析。使用該產品無需單獨進行PCR擴增，減少了手動操作，獲得的產物長度PCR方法更長（參見"Next-generation sequencing using REPLI-g amplified DNA requires less hands-on time and generates more sequence information than PCR-based methods"）。用擴增產物進行二代測序，獲得高品質結果。這表明該試劑盒的位點覆蓋率大，錯配率低，其擴增的DNA（甚至從單一細菌細胞中擴增的DNA）能夠與純化獲得的基因組DNA相媲美（參見"Comparable NGS results"）。另有研究對人類常染色體和X染色體上的多個標記物進行了分析，三個獨立的實驗均顯示：基因組的所有位點被成功擴增，沒有遺漏任何一個位點（參見"Complete genome coverage"）。

佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術的表現優(yōu)于其他供應商的試劑盒

其他供應商的試劑盒基于PCR技術進行全基因組擴增，獲得的產物片段較短，帶有PCR引物序列，可能影響下游應用?；赑CR的全基因組擴增容易出現錯誤，會導致堿基對突變、STR的減少或增多，使用低保真Taq DNA聚合酶會導致位點缺失。相反，REPLI-g Single Cell Kit能夠進行高度均一的全基因組擴增，位點偏差小。對四個試劑盒進行了檢測，其中兩個利用多重置換擴增技術（包括REPLI-g Single Cell Kit），另外兩個利用PCR技術。采用單一細胞擴增實驗方案對所有試劑盒進行序列位點檢測。除REPLI-g Single Cell Kit外的其他供應商的試劑盒都出現了位點的遺漏（參見"Unbiased DNA amplification from a single cell"）。

Principle

佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術含有REPLI-g sc Polymerase，這是一種優(yōu)化的新型高保真Phi 29聚合酶。該試劑盒采用多重置換擴增技術擴增復雜的基因組DNA，溫和的堿孵育能夠避免DNA片段化，促進對所有位點的無偏差擴增。該試劑盒十分適用于分離的腫瘤細胞或細菌細胞等單一細胞，能夠擴增獲得高產量DNA（參見表1）。此外，該試劑盒還配有專用于鮮血或干血、新鮮或冷凍組織的實驗方案，可用于多種研究樣本。常規(guī)DNA產量可達40 µg，對模板的起始量要求低，因此進行后續(xù)遺傳分析時無需檢測DNA濃度。REPLI-g Single Cell Kit的擴增產物平均長度超過10 kb，且覆蓋所有位點，適合于多種應用，包括二代測序、基于芯片技術的比較基因組雜交、焦磷酸測序和real-time PCR分析（參見表2）。

擴增原理

佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術采用等溫基因組擴增技術，即多重置換擴增（MDA）。六聚體與變性DNA隨機結合，然后在等溫條件下，在優(yōu)化的Phi 29聚合酶作用下，發(fā)生鏈置換合成反應。每個置換后的單鏈作為模板，與引物結合，可擴增獲得高產量DNA（參見"Multiple Displacement Amplification (MDA) technology"）。Phi 29聚合酶為噬菌體衍生酶，具有3'→5'引物外切酶活性（校正活性），其保真性是Taq DNA聚合酶的1000倍。Phi 29聚合酶在優(yōu)化的REPLI-g Single Cell緩沖液體系中，能夠輕松的打開發(fā)卡結構等二級結構，因此可促進擴增時聚合酶正常工作?？蓴U增獲得長達100 kb的DNA片段（參見"Unbiased amplification with Phi 29 polymerase"）。

細胞裂解和DNA的堿變性 

基因組DNA在用于酶促擴增反應前必須經過變性，而這一變性過程通常使用高溫或高pH值（強堿）孵育。佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術采用溫和的堿孵育，在細胞裂解、DNA變性的同時，確保DNA片段化程度小，不產生堿基突變。因此擴增獲得的DNA完整度高，產物長度長，覆蓋位點多（參見"Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation"）。

高效去除可檢測到的DNA污染

佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術中的所有組分都經過了獨特的去污染流程，避免擴增產物被污染。在標準化流程中，對緩沖液和試劑進行紫外線照射，確保其不會污染DNA（參見"Innovative decontamination procedure"）。紫外線照射后，對試劑盒的所有組分進行嚴格的質量控制，確保其性能。

Procedure

簡單的單管操作

佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術t可對單一細胞或有限的樣本進行簡便、高效、正確的全基因組擴增。反應體系構建十分便利、高效，僅需15分鐘左右的手動操作（參見"REPLI-g Single Cell Kit procedure"）。專用的緩沖液和試劑可對單一細胞、有限的組織材料、或純化的DNA進行擴增，產量高、位點覆蓋率大（參見表3）。REPLI-g技術擴增獲得的DNA可在–20°C長期儲存（參見"Consistent long-term stability"）。