【佳學(xué)基因檢測(cè)】分子診斷與基因檢測(cè)中的數(shù)字PCR技術(shù)
數(shù)字PCR是PCR技術(shù)發(fā)展過(guò)程中的第三代聚合物酶鏈擴(kuò)增技術(shù)。數(shù)字?jǐn)U增技術(shù)常寫(xiě)為DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR。雖然其基本原理仍然是1993年化學(xué)獎(jiǎng)得主美國(guó)生物化學(xué)家穆利斯發(fā)現(xiàn)的,但是佳學(xué)基因通過(guò)終點(diǎn)檢測(cè)計(jì)算目標(biāo)序列的拷貝數(shù),無(wú)需采用內(nèi)參和標(biāo)準(zhǔn)曲線即可進(jìn)行正確的先進(jìn)定量檢測(cè)。
數(shù)字PCR采用終點(diǎn)檢測(cè),不依賴于Ct值(循環(huán)閾值),所以數(shù)字PCR反應(yīng)受擴(kuò)增效率的影響降低,對(duì)PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力提高,具有很高的正確度和重現(xiàn)性。
由于具備高靈敏度、高正確度的特點(diǎn),基因檢測(cè)不易被PCR反應(yīng)抑制劑干擾,無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品可實(shí)現(xiàn)真正意義的先進(jìn)定量,而成為研究和應(yīng)用熱點(diǎn)。
根據(jù)反應(yīng)單元的不同形式,主要可分為微流體式、芯片式和微滴式三大類系統(tǒng)。
1)微流體數(shù)字PCR,Microfluidic digital PCR,mdPCR。
基于微流控技術(shù),對(duì)分子診斷DNA模板進(jìn)行分液,微流控技術(shù)能實(shí)現(xiàn)樣品納升級(jí)或更小液滴的生成,但液滴需要特殊吸附方式再與PCR反應(yīng)體系結(jié)合,mdPCR已逐漸被其他方式取代。
2)微滴數(shù)字PCR,Droplet-based digital PCR,ddPCR。
利用油包水微滴生成技術(shù)對(duì)分子診斷樣品進(jìn)行微滴化處理,將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的微滴,其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子,或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。
以伯樂(lè)的ddPCR為例,主要包括三個(gè)步驟:
圖片
先進(jìn),準(zhǔn)備樣本和生成微滴,如下圖,8x3的微孔板,一排加樣本,一排加油滴,通過(guò)微滴生成器每個(gè)樣本生成20000個(gè)微滴。
圖片
圖片
第二,進(jìn)行“油包水”PCR,把微孔板放入PCR擴(kuò)增儀,對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行40個(gè)熱循環(huán)的PCR反應(yīng)。
圖片
第三,讀取微滴結(jié)果,把微孔板放入讀取儀,通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)獲取每個(gè)微滴PCR終點(diǎn)結(jié)果的熒光信號(hào),并用泊松分布原理糾正結(jié)果。
圖片
Bio-rad去年上市的Bio-Rad QX ONE數(shù)字PCR系統(tǒng)整合了微滴生成、熱循環(huán)反應(yīng)及微滴讀取等步驟,賊大程度減少人工操作。
配備四個(gè)獨(dú)立的熒光檢測(cè)通道,結(jié)合ddPCR特有的高階多重PCR技術(shù),可以在單反應(yīng)孔中實(shí)現(xiàn)8重拷貝數(shù)變異(CNV)檢測(cè)、5重突變檢測(cè)或4重基因表達(dá)檢測(cè)。
圖片
3)芯片數(shù)字PCR,Chip-based digital PCR,cdPCR。
利用集成流體通路技術(shù)在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體,通過(guò)不同的控制閥門(mén)控制溶液在其中的流動(dòng),將樣本液體分成大小一致的納升級(jí)于反應(yīng)孔種進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng),實(shí)現(xiàn)基因檢測(cè)對(duì)特定基因序列的先進(jìn)定量。
以法國(guó)Stilla technologies 公司的cdPCR技術(shù)為例,主要包括以下步驟:
先進(jìn),加樣和生成微滴:將樣本和PCR反應(yīng)液加入微流控芯片,放入儀器中,儀器可通過(guò)物理方法生成單層平鋪的20000~30000個(gè)微滴陣列。
第二,對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行PCR擴(kuò)增:在Naica Geode微滴生成擴(kuò)增系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
第三,讀取和分析結(jié)果:將芯片置于Prism微滴讀取分析系統(tǒng)上進(jìn)行熒光信號(hào)采集,計(jì)數(shù)陰陽(yáng)性微滴,通過(guò)泊松分布計(jì)算獲得靶標(biāo)基因先進(jìn)拷貝數(shù)濃度。
圖片
總結(jié)一下,將分子診斷基因檢測(cè)樣本和PCR反應(yīng)液加入微流控芯片,放入儀器中,通過(guò)物理方法生成單層平鋪的微滴陣列,隨后對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行擴(kuò)增,然后進(jìn)行六通道熒光信號(hào)采集,計(jì)數(shù)陰陽(yáng)性微滴,通過(guò)泊松分布計(jì)算獲得靶標(biāo)基因先進(jìn)拷貝數(shù)濃度。
第三代PCR主要缺點(diǎn):
儀器和試劑昂貴。
采用這種分子診斷技術(shù)模板質(zhì)量要求較高,模板量超過(guò)微體系量將導(dǎo)致無(wú)法定量,過(guò)少則定量基因檢測(cè)正確度降低。
當(dāng)存在非特異性擴(kuò)增時(shí)也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性。
(責(zé)任編輯:佳學(xué)基因)