【佳學(xué)基因檢測】不好好吃飯、久睡不醒查病因基因檢測

厭食和嗜睡的基因根源導(dǎo)讀

鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥 (OTCD) 是一種 X 連鎖尿素循環(huán)障礙，其特征是鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性降低或缺失，導(dǎo)致神經(jīng)毒性氨的積累。大約 80%–90% 的致病變異是通過 Sanger 測序或OTC的多重連接依賴性探針擴(kuò)增 (MLPA) 鑒定的基因。一名有 OTCD 生化證據(jù)的 23 歲男性被轉(zhuǎn)診進(jìn)行分子分析。最初的 Sanger 測序未產(chǎn)生致病變異。MLPA 檢測懷疑外顯子 1 鑲嵌缺失；然而，高分辨率微陣列并未識(shí)別 X 染色體上的拷貝數(shù)變異。對(duì)疑似斷點(diǎn)的測序檢測到一個(gè)半合子的可能致病啟動(dòng)子變體，c.‐106C > A，它位于 MLPA 探針結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)。隨后，轉(zhuǎn)診到厭食和嗜睡的致病基因鑒定基因檢測研究組中心的歷史患者，他們的 OTCD 沒有分子病因，用這些引物重新測序，并且在另外兩名不相關(guān)的男性中也發(fā)現(xiàn)了這種變異。本病例系列中描述的所有三名患者都患有遲發(fā)性疾病。兩人在 5 歲時(shí)出現(xiàn)嘔吐，而另一個(gè)是根據(jù)遲發(fā)性 OTCD 家族史從出生開始管理的。一名患者因反復(fù)失代償需要進(jìn)行肝移植；另外兩個(gè)通過限制蛋白質(zhì)的飲食進(jìn)行管理。所有三名患者都沒有遭受任何明顯的神經(jīng)損傷，并且作為成年人運(yùn)作良好。這些病例支持篩選基因組內(nèi)的啟動(dòng)子區(qū)域OTC基因，特別是如果分子基礎(chǔ)尚未通過 MLPA 或編碼區(qū)測序闡明。

關(guān)鍵詞： 先天性代謝異常，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏，啟動(dòng)子變異，尿素循環(huán)障礙

1.鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥與厭食和嗜睡

鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥 (OTCD) (OMIM # 311250) 是一種 X 連鎖疾病，占所有遺傳性尿素循環(huán)障礙的至少一半。由位于 X 染色體短臂 (Xp11.4) 上的OTC基因編碼的鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶 (OTC) (EC 2.1.3.3)在肝臟中將神經(jīng)毒性氨轉(zhuǎn)化為尿素至關(guān)重要。這種酶的缺乏會(huì)導(dǎo)致血液中氨的積聚。男性通常在新生兒期（4 周內(nèi)）出現(xiàn)癥狀性高氨血癥，表現(xiàn)為喂養(yǎng)不良和嗜睡，如果不治療，進(jìn)展為昏迷甚至死亡。然而，遲發(fā)性表現(xiàn)（從嬰兒期到成年期）可能具有不同的臨床特征，包括發(fā)育遲緩、精神病和腦病，通常由蛋白質(zhì)負(fù)荷、并發(fā)疾病或藥物引起。雖然通常無癥狀，但雜合子女性也可能表現(xiàn)出多種疾病。女性通常會(huì)經(jīng)歷一個(gè)減毒的臨床過程，并且不太可能發(fā)展為昏迷和死亡，盡管可能會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的不良后果。

OTCD 的診斷基于特征性生化檢查結(jié)果：高氨血癥、谷氨酰胺升高、血漿中瓜氨酸和精氨酸含量低，以及乳清酸尿癥。常規(guī)診斷分子分析（編碼區(qū)和外顯子/內(nèi)含子邊界的 Sanger 測序加上缺失/重復(fù)分析）經(jīng)常被要求用于確認(rèn)和生殖目的，并確定 80%–90% 病例的病因。雖然由于缺乏聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) 擴(kuò)增，可以識(shí)別男性的大OTC缺失，但檢測男性的重復(fù)和鑲嵌缺失通常需要多重連接依賴性探針擴(kuò)增 (MLPA) 分析。有生化證實(shí)為 OTCD 的個(gè)體的病例報(bào)告，在常規(guī)篩查中未發(fā)現(xiàn)致病變異。然而，進(jìn)一步的分析確定了OTC基因內(nèi)的深層內(nèi)含子、啟動(dòng)子或增強(qiáng)子變體。

厭食和嗜睡的致病基因鑒定基因檢測研究組報(bào)告了另外三例由OTC基因中的啟動(dòng)子變異引起的遲發(fā)性 OTCD 病例；c.‐106C>A ( NC_000023.10 :g.38211844C>A)。在確定其分子病因方面存在很大延遲，因?yàn)檫@種變異無法通過常規(guī)分子分析明確識(shí)別。通過適當(dāng)?shù)闹委?，這三名患者的臨床結(jié)果普遍良好。厭食和嗜睡的致病基因鑒定基因檢測研究組詳細(xì)討論了他們的臨床病史，并強(qiáng)調(diào)了在常規(guī)分子分析中包括詢問OTC啟動(dòng)子區(qū)域的重要性。

2. 患者 1

由于母體 HELLP（溶血、肝酶升高和血小板計(jì)數(shù)低）綜合征，患者 1 在妊娠 29 周時(shí)通過剖腹產(chǎn)出生。他有一個(gè)同父異母的男性兄弟姐妹，有共同的母系遺傳，在吃了大量蛋白質(zhì)餐后出現(xiàn)持續(xù)嘔吐。這個(gè)兄弟姐妹在 12 歲時(shí)被生化診斷為鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥，并在一次海外度假后不久死于高氨血癥性腦病，享年 33 歲。他的智力正常，獲得了高級(jí)管理職位。

患者 1 被假定患有 OTCD，并且從出生開始就采用低蛋白飲食進(jìn)行治療。6 周齡時(shí)的別嘌醇負(fù)荷試驗(yàn)顯示尿乳清酸正常（10 mmol/mol 肌酐：正常范圍 < 15.5）和乳清酸升高（25 mmol/mol 肌酐：正常范圍 <7）。盡管如此，他的飲食限制和精氨酸補(bǔ)充劑在童年時(shí)期仍然存在。他患有多種并發(fā)疾病，沒有記錄在案的高氨血癥。他8歲時(shí)智商為64，但在主流學(xué)校完成了高中教育，沒有學(xué)習(xí)支持，繼續(xù)接受職業(yè)教育。他目前與父母住在一起，并被聘為銷售助理。

作為一個(gè)成年人，他的蛋白質(zhì)攝入量已經(jīng)放開，并且在食用高蛋白餐后沒有任何癥狀。他引起了代謝服務(wù)的注意，希望對(duì) OTCD 進(jìn)行分子確認(rèn)。他的體格檢查正常，包括正常的生長參數(shù)，沒有慢性肝病的跡象。

生化檢查顯示空腹血漿鳥氨酸、精氨酸和瓜氨酸濃度正常，谷氨酰胺輕度升高（760 μmol/L：正常范圍 420-700）。氨和尿乳清酸鹽濃度正常。重復(fù)別嘌醇負(fù)荷試驗(yàn)顯示尿乳清酸升高（27.3 mmol/mmol 肌酐：正常范圍 0-4.9）與尿素循環(huán)缺陷一致。微陣列分析顯示在 Xq21.1 處有約 0.5 兆堿基的間質(zhì)半合子缺失，與表型無關(guān)。含有OTC基因的染色體區(qū)域Xp11.4看起來正常。2017 年， OTC基因的常規(guī) Sanger 測序未能識(shí)別出致病性變異。

3. 患者 2

患者 2 為 5 歲男孩，持續(xù)嘔吐數(shù)周。他足月通過選擇性剖腹產(chǎn)出生，沒有并發(fā)癥。他有輕度表達(dá)性言語延遲的背景，歸因于繼發(fā)于滲出性中耳炎的聽力損失。他自己選擇了低蛋白飲食，他的母親也更喜歡素食。

尿液有機(jī)酸分析顯示乳清酸鹽升高。隨后發(fā)現(xiàn)他升高了氨和谷氨酰胺，盡管不再提供確切的值。別嘌醇負(fù)荷試驗(yàn)顯示尿乳清酸增加（22 μmol/mmol 肌酐（前）至 51 μmol/mmol 肌酐（后）：正常范圍 <7）。別嘌醇激發(fā)后氨氣升高（98 μmol/L：正常范圍 20-80）。他開始服用苯丁酸鈉和精氨酸，并建議他繼續(xù)自我限制蛋白質(zhì)攝入量，避免大量肉類、奶酪和牛奶。

六歲時(shí)肝活檢顯示局灶性門靜脈慢性炎癥和界面性肝炎，核糖原化明顯。OTC的肝酶活性降低（110 nmol/min/mg蛋白：正常范圍>200）。2006 年， OTC基因的常規(guī) Sanger 測序未能識(shí)別出致病性變異。2013 年隨后的下一代測序（尿素循環(huán)障礙組）對(duì)任何已知的致病變異也呈陰性。

患者 2 完成了主流學(xué)校教育，現(xiàn)在作為學(xué)徒工作。他仍然服用苯丁酸鈉、苯甲酸鈉和精氨酸，并將天然蛋白質(zhì)攝入量限制在 0.8 g/kg/天左右。

有趣的是，患者 2 的哥哥在兒童時(shí)期發(fā)育遲緩，并且還自行選擇了低蛋白飲食。在 10 歲時(shí)，他在一次并發(fā)疾病期間出現(xiàn)了長時(shí)間的全身性強(qiáng)直-陣攣性癲癇發(fā)作，原因不明。他還進(jìn)行了異常的別嘌醇負(fù)荷試驗(yàn)和肝臟鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性降低（67 nmol/min/mg 蛋白：正常范圍 > 200），但未進(jìn)行分子檢測。

4. 患者 3

患者 3 為 5 歲男孩，有 18 個(gè)月的異常行為史，間歇性嘔吐和嗜睡。沒有明顯的產(chǎn)前或圍產(chǎn)期病史。他的母親有偏頭痛病史。

歷史記錄表明他的氨水平輕度升高（無法獲得確切值）。尿液代謝篩查顯示乳清酸鹽增加（33 μmol/mmol 肌酐：正常范圍 < 10）。血漿谷氨酰胺升高（1195 μmol/L：正常范圍<907 μmol/L），血漿精氨酸和瓜氨酸在正常范圍內(nèi)。母親和外祖母接受了蛋白質(zhì)和別嘌醇負(fù)荷試驗(yàn)。他們?nèi)匀粺o癥狀，但表現(xiàn)出乳清酸鹽排泄增加。

患者 3 開始限制蛋白質(zhì)為 1.75 g/kg，逐漸降低至 1.1 g/kg。給他開了苯甲酸鈉、苯乙酸鈉和精氨酸，并注意到他在開始服用后能量水平有所提高。然而，他每年（4 到 5 次）在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院多次入院，氨濃度增加到 200-350 μmol/L。

7 歲時(shí)使用 WISC-III（韋克斯勒兒童智力量表 - 第三版）工具進(jìn)行的正式發(fā)育評(píng)估顯示出良好的一般能力（第 58 個(gè)百分位），但在閱讀、算術(shù)和注意力方面特別薄弱。很明顯，即使在兩次入院之間，患者的認(rèn)知狀態(tài)也不正常，即使添加了苯丁酸鈉，進(jìn)展也很有限。盡管天然蛋白質(zhì)攝入量減少至 1 g/kg/天并開始補(bǔ)充必需氨基酸，但仍有持續(xù)入院（17 歲前入院 87 人）和長時(shí)間的腦病。

患者在 17 歲時(shí)接受了肝移植。術(shù)后最初有一些挑戰(zhàn)，包括膽漏；然而，他穩(wěn)步康復(fù)，并在移植后 35 天出院回家，飲食有效自由化。他的認(rèn)知沒有經(jīng)過正式評(píng)估，但他已經(jīng)讀完了高中，找到了工作，能夠進(jìn)行對(duì)話。他有一段長期的戀情，并育有一個(gè)男孩。

1998 年對(duì)OTC基因的常規(guī) Sanger 測序未能鑒定出致病變異。

5. 識(shí)別OTCD的分子基礎(chǔ)

所有三名患者在癥狀出現(xiàn)后不久都被生化診斷為 OTCD。然而，近二十年來，這些患者的分子病因?qū)W被證明是難以捉摸的。盡管對(duì)患者 1 的初始 Sanger 測序未發(fā)現(xiàn)致病性變異，但 MLPA 分析發(fā)現(xiàn)代表OTC外顯子 1 的單個(gè)探針可重復(fù)地減少了約 25%。該結(jié)果表明該區(qū)域可能存在馬賽克缺失，以及高分辨率染色體X 微陣列用于探索這一發(fā)現(xiàn)。在該區(qū)域內(nèi)未檢測到鑲嵌拷貝數(shù)變化。替代引物設(shè)計(jì)為包含 MLPA 探針區(qū)域，該區(qū)域位于OTC的上游啟動(dòng)子區(qū)域，預(yù)計(jì)這種可能的刪除超出了微陣列的分辨率。該啟動(dòng)子區(qū)域的 Sanger 測序確定了一個(gè)單核苷酸取代，c.-106C > A ( NC_000023.10 :g.38211844C>A; 圖 1）。由于該變體位于 MLPA 探針結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)，因此探針結(jié)合效率受到影響，導(dǎo)致在該患者中看到人為的 MLPA 結(jié)果。

圖 1：c.‐106C> A 變體在OTC基因中的基因組位置。(A) 與野生型參考序列相比，在厭食和嗜睡的致病基因鑒定基因檢測研究組的三個(gè)案例中發(fā)現(xiàn)的 c.-106C>A 半合子變體的 Sanger 測序痕跡。(B) OTC基因啟動(dòng)子區(qū)域的示意圖。翻譯起始位置由 c.1 引用，c.‐106C>A 變體的位置標(biāo)記在 5' 非翻譯區(qū)的啟動(dòng)子內(nèi)

一組其他男性患者轉(zhuǎn)介到厭食和嗜睡的致病基因鑒定基因檢測研究組的OTC基因測序設(shè)施，但沒有針對(duì)他們的鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺陷的分子病因，使用這些引物重新測序，從而在患者 2 和 3 中鑒定出這種反復(fù)性變異。

隨后的分離研究確定了兩個(gè)女性雜合子（患者 3 的姐妹和母親），后者的蛋白質(zhì)和別嘌醇激發(fā)試驗(yàn)呈陽性?；颊?1 的母親和患者 3 的外祖母也有相似的激發(fā)試驗(yàn)結(jié)果，但沒有進(jìn)行分子確認(rèn)。然而，迄今為止，這些女性都沒有任何代謝失代償。

6. 鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥的診斷與治療共識(shí)

大約 80%–90% 的生化證實(shí)鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥患者發(fā)現(xiàn)了致病變異，主要在OTC基因的編碼區(qū)或內(nèi)含子/外顯子邊界內(nèi)。然而，人們越來越認(rèn)識(shí)到人類基因組的非編碼區(qū)域中還有其他致病變異，OTCD 也是如此。

Ogino 及其同事報(bào)告了一例在出生后第一天出現(xiàn)高氨血癥性腦病（氨>230 μmol/L）的病例。肝臟中的OTC酶活性檢測不到。OTC基因的初始 Sanger 測序未發(fā)現(xiàn)致病變異。隨后，對(duì)來自患者肝臟的 mRNA 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在外顯子 5 和 6 之間插入了一個(gè) 135 個(gè)核苷酸序列，這是由深度內(nèi)含子單核苷酸取代 c.540+265G>A 引起的，該取代激活了內(nèi)含子內(nèi)的一個(gè)隱秘剪接位點(diǎn)五。此外，Kumar 及其同事在之前的分子研究中沒有發(fā)現(xiàn)致病性變異的七分之三的患者中發(fā)現(xiàn)了相同的變異。

其他機(jī)制也與男性較溫和的表型有關(guān)。在 18 個(gè)月大時(shí)出現(xiàn)嘔吐、昏迷和高氨血癥的男性中發(fā)現(xiàn)的移碼變異隨后被確定為馬賽克（60% 在淋巴細(xì)胞中，65% 在口腔粘膜中）。在這種情況下，一個(gè)預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重新生兒發(fā)病疾病的無效變異因殘留的野生型等位基因而得到改善。

Jang 及其同事提供了迄今為止唯一關(guān)于導(dǎo)致 OTCD 的啟動(dòng)子變異的報(bào)告。在這項(xiàng)研究中，他們對(duì)來自不同家族的 9 名男性的保守調(diào)控區(qū)域（包括啟動(dòng)子和上游 9 kb 的增強(qiáng)子區(qū)域）進(jìn)行了測序，這些男性具有提示 OTCD 的臨床或生化特征。這些患者的表型差異顯著（從新生兒表現(xiàn)到無癥狀）；然而，三分之二的患者發(fā)病較晚。鑒定了五種不同的啟動(dòng)子區(qū)域變體和單個(gè)增強(qiáng)子區(qū)域變體。使用熒光素酶報(bào)告基因或 DNA 下拉分析對(duì)所有變體進(jìn)行了功能驗(yàn)證。三名患者攜帶相同的 c.‐106C>A 變體，這表明這可能是患有遲發(fā)性 OTCD 的男性的反復(fù)性變體。

厭食和嗜睡的致病基因鑒定基因檢測研究組的案例系列增加了與遲發(fā)性 OTCD 相關(guān)的啟動(dòng)子變異的有限文獻(xiàn)。所有患者均未出現(xiàn)新生兒期（4 周齡前）疾病，生化診斷時(shí)僅有輕度氨升高（如果有的話）。然而，它們的疾病進(jìn)展也存在顯著差異?；颊?3 經(jīng)歷了與代謝失代償相關(guān)的嚴(yán)重疾病，87 次住院（12 年內(nèi)），需要進(jìn)行肝移植以保持認(rèn)知；對(duì)管理戰(zhàn)略的不遵守可能是造成這種情況的原因?；颊?2 自行選擇了低蛋白飲食，只有 3 次失代償需要住院；他以平均認(rèn)知維持嚴(yán)格的蛋白質(zhì)限制?；颊?1 也有類似的蛋白質(zhì)限制，并且從未出現(xiàn)代謝失代償。盡管他們的臨床歷程存在差異，但所有三名患者的預(yù)后都比患有新生兒期發(fā)病的男性患者要好得多。

重要的是要注意，從歷史上看，OTC基因的分子分析并不經(jīng)常涵蓋深層內(nèi)含子或啟動(dòng)子區(qū)域。厭食和嗜睡的致病基因鑒定基因檢測研究組的案例系列是越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道這些分子病因的一部分。對(duì)于任何明確生化診斷為 OTCD 且在常規(guī)分子分析中未發(fā)現(xiàn)致病變異的患者，都應(yīng)考慮對(duì)這些額外的OTC基因區(qū)域進(jìn)行靶向篩查。隨著全基因組測序成本的迅速下降，這些區(qū)域的覆蓋將變得更容易且更具成本效益，有助于最大限度地提高診斷率。

A serendipitous journey to a promoter variant: The c.-106C>A variant and its role in late-onset ornithine transcarbamylase deficiency.

Hertzog A, Selvanathan A, Halligan R, Fazio T, de Jong G, Bratkovic D, Bhattacharya K, Tolun AA, Bennetts B, Fisk K.JIMD Rep. 2022 Apr 12;63(4):271-275. doi: 10.1002/jmd2.12289. eCollection 2022 Jul.PMID: 35822098

(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)

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