【佳學(xué)基因檢測】 為什么線粒體病需要基因檢測分子診斷？

線粒體病基因檢測導(dǎo)讀：

線粒體病是一種兒童常見的遺傳代謝疾病，患病率至少為1/5000。由于線粒體廣泛分布于人體各器官，因此該病的臨床特點是人體組織的多個器官會受到疾病的影響，常見受到影響的部位包括腦、骨骼肌、眼、耳、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、腎臟和血液系統(tǒng)等。

線粒體可視為人體的“能量工廠”，提供了90%以上的ATP，因此對于能量需求較大的組織，如腦、骨骼肌、肝臟、心肌和視網(wǎng)膜等，線粒體分布較多，反之亦然，造成了線粒體分布異質(zhì)性。

線粒體病的遺傳方式復(fù)雜，涉及到線粒體基因(mtDNA)的母系遺傳和核基因(nDNA)的孟德爾遺傳，遺傳異質(zhì)性較強(qiáng)，給基因診斷和分子檢測帶來了一定的困難。一般的診斷流程包括臨床表現(xiàn)、生化代謝和影像學(xué)檢查等，當(dāng)高度懷疑線粒體病時，需要進(jìn)行基因檢測。如果基因檢測結(jié)果為陰性，應(yīng)重新進(jìn)行臨床評估，若仍然懷疑線粒體病，則需要進(jìn)行肌肉或皮膚活檢，并進(jìn)行病理學(xué)分析和呼吸鏈酶學(xué)檢測，同時進(jìn)行組織標(biāo)本的遺傳學(xué)分析。

由于線粒體病牽涉到多個基因，傳統(tǒng)的一代基因檢測方法需要逐個基因篩選，這不僅費時費力，而且成本高，同時檢出率也不盡如人意。自2009年起，隨著二代測序技術(shù)在線粒體病診斷中的應(yīng)用，基因診斷取得了巨大進(jìn)步。這項技術(shù)的應(yīng)用使得我們能夠診斷和了解一些罕見的線粒體病，提高了診斷水平，但也帶來了一些新的困難。如何有效地將傳統(tǒng)的基因診斷方法與二代測序技術(shù)相結(jié)合，以及如何合理運用和解讀二代測序結(jié)果，是提高我國兒童線粒體病診治水平的關(guān)鍵問題。這需要廣大臨床醫(yī)生認(rèn)真思考和努力探索。

一、兒童常見線粒病的臨床表現(xiàn)及遺傳特點

1. 線粒體腦肌病伴乳酸酸中毒和卒中樣發(fā)作(mitochondrial encephalomyopathy，lactic acidosis，and stroke-like episodes，MELAS)：

這是兒童時期賊常見的母系遺傳線粒體腦肌病，以進(jìn)行性腦病、癲癇發(fā)作、眼瞼下垂、肌無力、易疲勞、乳酸酸中毒和卒中樣發(fā)作為特征，伴有多毛、身材矮小等。頭顱CT或MRI多表現(xiàn)為非血管分布的腦梗死樣改變，以頭部后面為主，后期出現(xiàn)皮質(zhì)及小腦萎縮，基底節(jié)區(qū)也可受累，表現(xiàn)為對稱性鈣化。當(dāng)臨床懷疑本病時，可以直接進(jìn)行mtDNA A3243G檢測。80％的MELAS由編碼tRNA Leu基因的A3243G突變所引起，其次為tRNA Leu的T3271C，占7％-15％。其他致病突變包括G583A、C3256T、T3291C、G3697A、G4332A、G12147A、G13513A和A13514G等。

2. 肌陣攣癲癇伴破碎紅肌纖維(myoclonic epilepsy associated with ragged red fibers，MERRF)：

這是另一種母系遺傳線粒體腦肌病，較MELAS少見，臨床以肌陣攣發(fā)作、癲癇、共濟(jì)失調(diào)和乳酸增高為主要特征。臨床懷疑本病時可直接進(jìn)行mtDNA A8344G突變檢測。MERRF賊常見的mtDNA突變?yōu)榫幋atRNA Lys的A8344G，其他致病突變包括T8356C、G8363A、G12147A、7472insC等。

3. Leber遺傳性視神經(jīng)病(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)：

為母系遺傳的線粒體病，呈急性或亞急性起病，病前身體健康，以雙眼微痛性視力減退為主要表現(xiàn)，雙側(cè)同時發(fā)病占25％，雙眼先后發(fā)病者占75％，間隔6-8周。男性青壯年好發(fā)，G11778A、T14484C、G3460A 3種突變占LHON的95％以上。臨床懷疑LHON可直接檢測上述3種突變位點。

4. Kearns-Sayre綜合征(Kearns-Sayre syndrome，KSS)、Pearson綜合征和慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹(chronic progressive external ophthalmoplegia，CPEO)：

這是3種較常見的線粒體缺失綜合征，其發(fā)病機(jī)制相似，臨床癥狀取決于mtDNA缺失片段的大小及區(qū)域和在不同組織中的分布。除Pearson綜合征能在血液標(biāo)本中檢測到大片段缺失外，其他兩種只能在肌肉組織中檢出。

5. Leigh綜合征(Leigh syndrome，LS)又稱為亞急性壞死性腦脊髓病(subacute necrotizing encephalomyelopathy)：

這是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，是嬰幼兒期賊常見的線粒體腦病。其典型表現(xiàn)為認(rèn)知及運動功能的迅速退化，以及頭顱MRI顯示基底節(jié)或腦干對稱性病灶。

Leigh綜合征（LS）的遺傳特征復(fù)雜，表現(xiàn)出賊高的遺傳異質(zhì)性。該病與線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)中任意一種呼吸鏈酶復(fù)合物的缺陷或聯(lián)合缺陷有關(guān)，其中以呼吸鏈酶復(fù)合物I和IV的缺陷賊為常見。此外，輔酶Q10缺陷和丙酮酸代謝障礙也可能引起該病。如果是由線粒體基因編碼的呼吸鏈酶復(fù)合物I、III、IV和V的缺陷引起的LS，則稱為母系遺傳的Leigh綜合征（MILS）。在MILS中，T8993G/C突變約占10%，其他突變?nèi)鏕13513A、T14487C等占10%-20%。

根據(jù)臨床表現(xiàn)和頭顱MRI的改變，臨床診斷LS并不困難。然而，由于致病基因的多樣性，傳統(tǒng)的一代基因檢測方法不僅耗時長、費用高，而且檢出率低。因此，二代基因檢測技術(shù)更適用于該病的診斷。

6. Alpers-Huttenlocher綜合征：

是由POLG基因突變導(dǎo)致的以藥物難治性癲癇、精神運動發(fā)育遲滯和肝臟受累為主的一種線粒體病，丙戊酸可誘發(fā)肝衰竭，多數(shù)患兒在發(fā)病后幾個月內(nèi)死亡，個別可生存數(shù)年。頭顱MRI顯示枕葉皮層急性缺氧改變。臨床懷疑本病時可檢測POLG基因。

二、線粒病的分子診斷如何選擇標(biāo)本和基因檢測技術(shù)？

有效地選擇樣本和基因檢測技術(shù)的前提是深入了解線粒體病的臨床和遺傳特點。只有掌握了這些特征，才能做出明智的選擇，避免走彎路，提高診斷正確率。線粒體病的臨床表現(xiàn)十分復(fù)雜，有些呈現(xiàn)典型或非典型綜合征，而有些則無法歸類為特定的線粒體綜合征。同樣的臨床表型可能對應(yīng)不同的基因型，而同一基因型在不同患者身上可能表現(xiàn)出不同的臨床表現(xiàn)，這些特征使線粒體病的診斷變得更加困難。

對于一些典型的線粒體綜合征，通過mtDNA熱點突變篩查可以確診大多數(shù)患者，例如，通過檢測A3243G突變可以確診MELAS，檢測A8344G突變可以確診MERRF，檢測G11778A、T14484C和G3460A三種突變可以確診LHON，檢測T8993G/C、G13513A和T14487C三種突變可以確診MILS。因此，mtDNA熱點突變篩查仍然是線粒體病分子診斷的首要步驟。當(dāng)血樣本未檢測到突變時，需要排除假陰性結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增長，血液中A3243G突變的檢測率逐漸降低，而尿液樣本的陽性率高于血液樣本，因此賊好同時檢測血液和尿液樣本。在排除假陰性結(jié)果后，如果mtDNA全基因組(16569bp)測序為陰性，則需要進(jìn)行肌肉病理學(xué)檢查，并選擇肌肉樣本進(jìn)行mtDNA全測序。在進(jìn)行線粒體母系遺傳的分子學(xué)診斷過程中，必須考慮到組織分布的特異性。對于臨床表現(xiàn)不典型、無法歸類為特定綜合征的患者，也可以直接進(jìn)行mtDNA全基因組測序。

由于LS遺傳復(fù)雜，賊好的辦法是通過組織標(biāo)本或皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行呼吸鏈酶活性測定，在酶學(xué)基礎(chǔ)上再進(jìn)行基因篩查。線粒體疾病的基因檢測基因解碼的分析表明，180例線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物IV缺陷，47例發(fā)現(xiàn)SURFl基因突變；而國內(nèi)在145例LS中，僅2例發(fā)現(xiàn)SURF1基因突變。酶學(xué)檢測可以提高基因確診率，但組織酶活性測定需要嚴(yán)格的實驗室條件和技術(shù)要求，且為有創(chuàng)性檢查，建議直接采用基因檢測。

隨著二代測序技術(shù)的進(jìn)步，通過基因捕獲技術(shù)，能夠針對目標(biāo)基因或全外顯子進(jìn)行高通量、簡便、快速、低成本的平行測序。這種方法使得大量候選基因或全外顯子可以同時進(jìn)行測序，為一些線粒體病患者提供了避免創(chuàng)傷性檢查的可能性，從而在線粒體病的診斷方面取得了重大突破，尤其是對于Leigh綜合征（LS）和一些罕見的線粒體病。通過逐步認(rèn)識和了解這些通過基因確診的線粒體病的臨床表型，可以為未來的診斷提供重要的線索，總結(jié)規(guī)律，縮小篩查范圍，甚至可以直接通過一代Sanger測序來進(jìn)行致病基因的檢測。

舉例來說，佳學(xué)基因病例集中曾經(jīng)收治過一個2歲3個月的患者，表現(xiàn)為松軟兒癥狀，乳酸輕度增高，尿代謝篩查提示甲基丙二酸輕度增高，血液串聯(lián)質(zhì)譜顯示丙酰肉堿(C3)、甲基丙二酰肉堿(C4DC)輕度升高，頭顱MRI示雙側(cè)尾狀核頭部、殼核對稱性異常。盡管臨床上不符合甲基丙二酸尿癥的表現(xiàn)，但考慮到可能是LS。然而，直到3年后，通過佳學(xué)基因的靶向基因捕獲測序，臨床醫(yī)師才確診為SUCLA2基因的突變，明確將患者診斷為線粒體DNA耗竭綜合征。有了這一經(jīng)驗，第2例患者通過基因檢測，很快就得到了確定性診斷。

三、對線粒體的基因檢測結(jié)果如何進(jìn)行分析和解讀？

進(jìn)行mtDNA全基因組測序不僅可以篩查致病性點突變和片段缺失，還能檢測到一些致病性不明的點突變。然而，在基因診斷中存在一些陷阱，需要結(jié)合豐富的遺傳學(xué)知識和臨床經(jīng)驗做出判斷。例如，D-loop是線粒體DNA環(huán)上少有的非編碼區(qū)，一般來說，檢測到D-loop區(qū)的突變通常不會導(dǎo)致疾病。

mtDNA全基因組包含37個基因，共計16569個堿基對，呈裸露的環(huán)狀雙螺旋結(jié)構(gòu)，不含有內(nèi)含子。由于氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的大量氧自由基，線粒體DNA較易發(fā)生突變，其突變率比核DNA高出10至17倍，而且線粒體DNA本身不具備自我修復(fù)的能力。

目前，人類線粒體基因組數(shù)據(jù)庫MITOMAP（http://www.mitomap.org）收錄了60個已被證實的致病點突變。如果在檢測中發(fā)現(xiàn)了這些突變，并且臨床表型也符合，那么可以做出確診。鑒于線粒體遺傳多為母系遺傳，建議進(jìn)行母系成員的致病突變檢測，同時采樣血液和尿液以避免假陰性結(jié)果。

然而，對于已有報道的突變，需要進(jìn)行嚴(yán)格的分析，而不是盲目下診斷。首先，要確認(rèn)臨床表現(xiàn)是否相符，其次要檢索突變是否影響蛋白結(jié)構(gòu)和功能，并查看是否有相關(guān)的功能研究支持。舉例來說，我們曾診斷一名患有線粒體DNA耗竭綜合征的兒童，但檢測到的mtDNA G5821A 100％突變被文獻(xiàn)報道為與耳聾相關(guān)，與患者的臨床表現(xiàn)不符，且致病意義不明。因此，不能單純依據(jù)此突變進(jìn)行診斷。

因此，對于通過mtDNA全基因組測序發(fā)現(xiàn)的突變，必須進(jìn)行嚴(yán)格的篩查。只有那些在人類線粒體基因組數(shù)據(jù)庫MITOMAP中已被證實為致病性的突變才能做出確診，對于尚未經(jīng)過證實的突變，需要慎重評估后才能做出診斷。

針對核基因的靶向捕獲測序結(jié)果，如果發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有報道的致病性突變，并且該突變與患者的臨床表現(xiàn)和遺傳方式相符合，那么可以做出診斷。

然而，對于尚未報道過的新突變，臨床醫(yī)生需要結(jié)合遺傳學(xué)意義和臨床綜合分析，從以下幾個方面進(jìn)行致病性的推測：

非已知的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)：查詢SNPs數(shù)據(jù)庫，并在大規(guī)模正常對照群體（如千人基因組或本地正常人）中確認(rèn)未檢測到此變異。

突變對蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響：此類突變可能包括移碼、剪切、缺失和無義突變，或者經(jīng)過功能預(yù)測軟件預(yù)測位于高度保守區(qū)、導(dǎo)致氨基酸變異較大的錯義突變。

符合孟德爾遺傳特征：突變符合孟德爾遺傳規(guī)律，即在家系中呈現(xiàn)經(jīng)典的遺傳模式。

通過以上分析，可以對新突變的致病性進(jìn)行初步的推測和評估。

無論是傳統(tǒng)測序還是二代測序診斷線粒體病，其確診率仍然維持在30%左右。線粒體的結(jié)構(gòu)和功能涉及1500多個基因，但目前已發(fā)現(xiàn)的致病基因僅有200余個，這意味著基因診斷率并不高。 對于那些基因檢測結(jié)果為陰性，但臨床上仍然高度懷疑患有線粒體病的患者，需要進(jìn)行組織標(biāo)本的酶活性檢測。呼吸鏈酶復(fù)合物I是其中分子量賊大、結(jié)構(gòu)賊復(fù)雜的部分，含有44個亞基。已經(jīng)確定其中有7個亞基由線粒體基因編碼，另外由核基因編碼的16個亞基基因突變與線粒體病有關(guān)，但其余的亞基致病性尚不清楚，這意味著大約一半的亞基的致病性還不為人所知。 

綜上所述，線粒體病是一種臨床和遺傳異質(zhì)性較高的疾病。在診斷典型線粒體綜合征時，應(yīng)首先選擇敏感的組織進(jìn)行熱點突變篩查，而不是盲目進(jìn)行二代測序。 隨著遺傳學(xué)檢測技術(shù)的飛速發(fā)展，檢測成本不斷降低，檢測時間不斷縮短，這為遺傳異質(zhì)性較強(qiáng)和罕見的線粒體病帶來了新的機(jī)遇和發(fā)展。相信在不久的將來，會有越來越多的致病基因被發(fā)現(xiàn)，越來越多的線粒體病得到診斷。這不僅將為患者的治療和預(yù)后評估提供重要依據(jù)，還將為患者及其家屬提供遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷服務(wù)。同時，這也將為線粒體病發(fā)病機(jī)制和靶向治療的研究奠定基礎(chǔ)。