【佳學(xué)基因檢測】線粒體疾病基因檢測結(jié)果如何獲得有效的治療

線粒體基因檢測如何指導(dǎo)線粒基因編輯從而實現(xiàn)線粒體病的正確治療？

線粒體基因檢測可以為線粒體基因編輯提供重要的指導(dǎo)，從而實現(xiàn)線粒體病的正確治療。具體來說，線粒體基因檢測可以幫助在以下幾個方面進(jìn)行指導(dǎo)：

確定致病基因和突變類型： 線粒體基因檢測可以幫助確定患者攜帶的致病基因和突變類型。這對于選擇合適的編輯目標(biāo)和制定編輯策略至關(guān)重要。不同的線粒體病可能由不同的基因突變引起，因此了解具體的突變類型有助于針對性地進(jìn)行編輯治療。

評估突變影響： 線粒體基因檢測可以幫助評估突變對線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響程度。某些突變可能會導(dǎo)致線粒體功能障礙或代謝紊亂，而其他突變可能對線粒體功能影響較小。通過評估突變的影響，可以更好地確定編輯的優(yōu)先級和目標(biāo)。

指導(dǎo)編輯策略： 根據(jù)線粒體基因檢測結(jié)果，可以制定針對性的編輯策略。例如，針對特定基因的突變，可以選擇合適的基因編輯技術(shù)和編輯器。此外，對于不同類型的突變，可能需要采用不同的編輯方法，如基因修復(fù)、基因替換或基因靜默等。

監(jiān)測治療效果： 線粒體基因檢測還可以用于監(jiān)測治療效果。通過定期進(jìn)行基因檢測，可以評估編輯治療的效果和持久性。如果檢測結(jié)果顯示突變負(fù)荷降低或病情改善，這將有助于確認(rèn)治療的有效性，并指導(dǎo)后續(xù)治療方案的調(diào)整。

綜上所述，線粒體基因檢測為線粒基因編輯提供了重要的指導(dǎo)，有助于實現(xiàn)線粒體病的正確治療。通過全面了解患者的基因突變情況，制定針對性的編輯策略，并監(jiān)測治療效果，可以更好地應(yīng)用基因編輯技術(shù)進(jìn)行線粒體疾病的治療。

線粒體基因檢測后的正確治療

線粒體DNA（mtDNA）突變可能引發(fā)多種遺傳病。近年來，mtDNA編輯技術(shù)作為一種新興的治療手段逐漸嶄露頭角，其基本原理主要基于蛋白質(zhì)或核酸的識別靶點，盡管核酸識別型mtDNA編輯技術(shù)相對較少。代表性的蛋白質(zhì)識別型mtDNA編輯技術(shù)包括鋅指核酸酶技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶技術(shù)和堿基編輯技術(shù)，在其研究中取得了一定的進(jìn)展。然而，由于設(shè)計復(fù)雜的識別序列，這些技術(shù)在進(jìn)一步推廣應(yīng)用時受到了一定的阻礙。

相比之下，CRISPR/Cas9等核酸識別型編輯技術(shù)因其結(jié)構(gòu)簡單、易于設(shè)計和修飾的特點而顯示出顯著的優(yōu)勢。然而，缺乏有效將核酸遞送進(jìn)入線粒體的方法限制了這些技術(shù)在mtDNA編輯領(lǐng)域的應(yīng)用。隨著對內(nèi)源性和外源性核酸遞送途徑的研究以及對DNA修復(fù)機制的深入了解，越來越多的證據(jù)表明核酸遞送是可行的，并且核酸識別型mtDNA編輯技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。

佳學(xué)基因檢測為了更好地服務(wù)基因檢測基因解碼患者，總結(jié)了當(dāng)前線粒體基因編輯技術(shù)的原理和發(fā)展現(xiàn)狀，并展望了核酸識別型mtDNA編輯技術(shù)的潛在價值。這些技術(shù)的發(fā)展為正確治療線粒體疾病提供了新的可能性，為改善患者的生活質(zhì)量和治療效果帶來了希望。

線粒體疾病基因檢測結(jié)果如何獲得有效的治療關(guān)鍵詞

 線粒體, CRISPR, 基因編輯, 核酸遞送, 綜述

線粒體病的發(fā)生原因及其正確治療策略

線粒體作為細(xì)胞的能量和代謝中心，在調(diào)節(jié)細(xì)胞信號通路、呼吸作用、分解代謝和細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它是雙層膜半自主性細(xì)胞器，內(nèi)部含有獨立于細(xì)胞核DNA（nDNA）的線粒體DNA（mtDNA）。由于活性氧等因素的作用，mtDNA的突變率比nDNA高出100倍。通常情況下，mtDNA的拷貝數(shù)在2至10個之間，其結(jié)構(gòu)類似于質(zhì)粒的雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)。人類mtDNA的長度為16,569個堿基對，編碼著37個基因，其中包括12S rRNA和16S rRNA、22種tRNA以及13種多肽。

mtDNA的突變可能導(dǎo)致線粒體代謝酶缺陷、ATP合成障礙和細(xì)胞能量不足，從而導(dǎo)致機體功能障礙。細(xì)胞內(nèi)可能含有上萬甚至十幾萬個mtDNA拷貝，當(dāng)突變的mtDNA占比超出一定閾值時，就會出現(xiàn)臨床癥狀。據(jù)已知，近90個致病性突變與mtDNA相關(guān)，每5000至10,000人中就可能有1人受到其影響。研究表明，幾十種遺傳性疾病，如線粒體肌病，與mtDNA的突變有關(guān)。由于母系遺傳，攜帶突變mtDNA的女性很難孕育健康的孩子。主流的線粒體置換治療雖然存在一定潛在風(fēng)險，但也為解決線粒體遺傳病提供了一種可能途徑。然而，對于許多患者來說，傳統(tǒng)藥物治療并不總是有效，因此需要尋求創(chuàng)新治療手段。

隨著各種新型編輯系統(tǒng)的不斷涌現(xiàn)，mtDNA編輯技術(shù)逐漸得以發(fā)展。然而，受限于線粒體膜的特殊性和mtDNA修復(fù)機制，這些技術(shù)仍面臨著一些挑戰(zhàn)。目前，mtDNA編輯的主要方法是利用鋅指核酸酶（ZFN）和類鋅指核酸酶（TALEN）等蛋白質(zhì)識別型編輯技術(shù)，將具有堿基序列識別能力的蛋白質(zhì)引入線粒體內(nèi)，然后在線粒體中進(jìn)行編輯。與之相比，CRISPR技術(shù)等核酸識別型編輯技術(shù)由于其易于設(shè)計和修飾的特點而備受關(guān)注。然而，由于缺乏有效的核酸遞送方法，這些技術(shù)在mtDNA編輯領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。解決這一難題將有助于增強mtDNA編輯的廣譜性，并為線粒體遺傳病的治療提供新的突破口。本文概述了各種成熟或正在開發(fā)中的以蛋白質(zhì)或核酸識別靶點為基礎(chǔ)的編輯技術(shù)在mtDNA編輯中的潛力，并評估了核酸識別型編輯技術(shù)在mtDNA領(lǐng)域中的發(fā)展前景。

圖1：線粒體病的基因編輯治療

ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9等基因編輯工具通過MTS途徑、親脂性陽離子、物理手段、膜融合脂質(zhì)體等方法導(dǎo)入線粒體后發(fā)揮功能，引發(fā)mtDNA的雙鏈斷裂現(xiàn)象或單堿基替換，再分別通過降解修復(fù)或切除修復(fù)降低突變mtDNA所占的比例，賊終實現(xiàn)了mtDNA編輯過程. A：mtDNA編輯技術(shù)的模型. a：賊原始的ZFN模型，融合表達(dá)了MTS、ZFP和Fok Ⅰ，MTS協(xié)助蛋白質(zhì)進(jìn)入線粒體后將被降解，ZFP識別特定的靶點基因，F(xiàn)ok Ⅰ具有核酸酶活性切割mtDNA；b：堿基編輯器技術(shù)，使用MTS協(xié)助蛋白質(zhì)進(jìn)入線粒體，TALE識別靶基因，DddA具有脫氨酶活性，可修改單個堿基；c：CRISPR-Cas9技術(shù)，使用MTS協(xié)助Cas9進(jìn)入線粒體，但sgRNA進(jìn)入線粒體的方法和效率仍在研究階段. B：各種編輯工具進(jìn)入線粒體可能的手段. C：編輯工具進(jìn)入線粒體后通過一些修復(fù)機制實現(xiàn)突變mtDNA比例降低. MTS：線粒體靶向序列；ZFP：鋅指蛋白；TALE：轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)器；DddA：雙鏈DNA脫氨酶毒素A；CRISPR：成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列；Cas：CRISPR關(guān)聯(lián)；sgRNA：小向?qū)NA；DSB：DNA雙鏈斷裂；ZFN：鋅指核酸酶；TALEN：轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶；mtDNA：線粒體DNA.

為什么線粒體病經(jīng)過基因檢測后可以進(jìn)行基因編輯治療？

基因編輯系統(tǒng)可以分為識別結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域兩部分，根據(jù)識別結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)還是核酸分為兩類，前者以ZFN與TALEN為代表，后者則是CRISPR技術(shù)。兩類識別結(jié)構(gòu)域與不同的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行組合可以衍生出堿基編輯技術(shù)、PE技術(shù)等多種新興技術(shù)。

蛋白質(zhì)識別序列

RE技術(shù)

RE技術(shù)源于賊初在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的甲基轉(zhuǎn)移酶和核酸內(nèi)切酶，其特點是不攜帶識別元件。RE與甲基轉(zhuǎn)移酶的識別序列相同，因此能夠通過甲基化保護(hù)序列免于切割。由于線粒體膜的特殊性，RE要進(jìn)入線粒體需要與線粒體定位信號（MTS）融合表達(dá)，而MTS能夠被細(xì)胞質(zhì)分子伴侶MSF識別，從而成功將RE帶入線粒體內(nèi)。突變的mtDNA往往會產(chǎn)生新的酶切位點，RE能夠識別并切割突變的mtDNA，從而降低突變比例。mitoPstI是先進(jìn)個用于哺乳動物線粒體的RE，隨后SmaI被調(diào)整用于切割與NARP綜合征和亞急性壞死性腦脊髓病相關(guān)的mtDNA突變位點。然而，RE存在著靶點限制性的問題，因為mtDNA上包含大量與目標(biāo)無關(guān)的序列可被切割。治療效果極度依賴于RE本身的精度，因此存在著可能導(dǎo)致脫靶效應(yīng)的風(fēng)險。因此，開發(fā)更加正確和安全的mtDNA編輯技術(shù)迫切需要解決靶點特異性的問題，需要尋找具有序列識別功能，能夠定位到特定基因的元件。

ZFN技術(shù)

ZFN技術(shù)利用DNA識別域和DNA剪切域來實現(xiàn)其功能。DNA識別域通常由三或四個鋅指結(jié)構(gòu)域串聯(lián)組成，也稱為鋅指蛋白，而DNA剪切域則是核酸內(nèi)切酶FokⅠ。鋅指蛋白廣泛存在于真核細(xì)胞中，其骨架具有保守的β-β-α二級結(jié)構(gòu)，賊常見的DNA結(jié)合基序為Cys2-His2-鋅指。鋅指蛋白通過疏水相互作用以及Cys和His與鋅離子的配位來保持穩(wěn)定。然而，鋅指蛋白的重復(fù)次數(shù)和連接子長度存在很大差異。FokⅠ包含有分子量為41,000的氨基端識別結(jié)構(gòu)域和分子量為25,000的羧基端裂解結(jié)構(gòu)域，該酶在鎂離子的輔助下與DNA結(jié)合后會形成二聚體并具有催化活性。ZFN技術(shù)已成功應(yīng)用于mtDNA編輯，通過MTS和NES能夠幫助ZFN靶向線粒體，并同時降低對nDNA的損傷，F(xiàn)okⅠ則切割mtDNA后誘導(dǎo)受損DNA的降解。

鋅指蛋白的特異性和FokⅠ的核酸毒性對ZFN技術(shù)影響巨大。鋅指蛋白的單個α螺旋需要同時識別3~4個堿基位點才能發(fā)揮作用，而獲取特異的鋅指蛋白增加了設(shè)計難度，其低靈活性和高復(fù)雜性在一定程度上限制了其應(yīng)用。FokⅠ可能存在潛在的脫靶核酸毒性，例如同源二聚體或在特殊情況下單體引發(fā)的核酸切割。此外，ZFN技術(shù)的遞送形式和免疫原性也是其發(fā)展受限的重要因素之一。研究人員進(jìn)行了一些改進(jìn)，例如Minczuk等人對FokⅠ進(jìn)行了改良，添加了兩個柔性接頭，有效減少了同源ZFN誤識別引起的mtDNA脫靶效應(yīng)。然而，長片段缺失突變難以識別，并且存在較強的組成性細(xì)胞毒性。另一方面，Gammage等人調(diào)整了元件順序，試圖通過強制ZFN異源二聚來降低脫靶率。他們使用腺相關(guān)病毒遞送的全身給藥線粒體ZFN成功誘導(dǎo)了心臟突變mtDNA的特異性消除。這些優(yōu)化措施極大地推動了ZFN技術(shù)的發(fā)展，但鋅指蛋白設(shè)計的復(fù)雜性仍然限制了其應(yīng)用。

TALEN技術(shù)

TALEN技術(shù)由TALE蛋白和FokⅠ酶組成。TALE蛋白主要包括中心結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)重復(fù)序列、核定位信號和酸性轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。中心結(jié)構(gòu)域由33~35個氨基酸組成的重復(fù)單元構(gòu)成，也是DNA結(jié)合域。串聯(lián)重復(fù)序列高度保守，其中第12和第13個氨基酸是可變區(qū)，其中第12號殘基起到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，而第13號殘基則負(fù)責(zé)特異性識別堿基。每個重復(fù)序列對應(yīng)于一個核苷酸，通過實驗和計算的方法來解析，通常C、T、A被HD、NG、NI所識別。

在用于mtDNA編輯時，TALEN也需要通過MTS進(jìn)行修飾。已經(jīng)設(shè)計的TALEN用于識別并敲除m.C5024T突變，而mito-TALEN也被用于阻斷線粒體疾病的代際傳播。Bacman等研究者發(fā)現(xiàn)，在處理后，14459A-mito-TALEN使得正常mtDNA的百分比增加到85%和90%。通過腺相關(guān)病毒9-mito-TALEN的肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)注射給藥，研究者大大減少了突變mtDNA的負(fù)荷。

相比鋅指蛋白，TALE具有更高的特異性，能夠特異性識別堿基。然而，構(gòu)建長串TALE所需的重復(fù)序列之間的聯(lián)系成為難點。目前，實現(xiàn)快速組裝自定義TALE的策略包括“金門”分子克隆、高通量固相組裝和連接非依賴性克隆技術(shù)等。然而，與鋅指蛋白類似，固有的設(shè)計復(fù)雜性始終限制了TALEN技術(shù)的深入發(fā)展。此外，復(fù)雜的設(shè)計和長串的序列也導(dǎo)致mito-TALEN具有更大的分子量，從而阻礙了病毒的包裝、細(xì)胞和線粒體的進(jìn)入。TALEN技術(shù)也存在脫靶現(xiàn)象、費用昂貴且費時、可能會引起機體免疫反應(yīng)等問題。

堿基編輯技術(shù)

ZFN和TALEN不能應(yīng)用于同質(zhì)mtDNA突變，因為破壞所有mtDNA是有害的，細(xì)菌基因組含有的脫氨酶為正確編輯提供了可能。細(xì)菌脫氨酶是一類細(xì)菌毒素，往往識別ssDNA，胞苷脫氨酶DddA則能作用dsDNA。DddA與載脂蛋白B mRNA編輯酶具有同源性，載脂蛋白B mRNA編輯酶有一個保守的胞苷脫氨酶折疊區(qū)域，保守的Cys、His、Glu殘基及鋅離子激活的水分子參與胞苷環(huán)親核攻擊和質(zhì)子穿梭［40］。DddA則有一個中央β片封閉活性位點，某個螺旋上的E1347和H1345可能發(fā)揮了類似的功能，區(qū)別是羧基末端的β鏈呈現(xiàn)反平行。DddA對5 ´ -TC上下游序列具有強烈偏好性，尿嘧啶DNA糖基化酶移除尿嘧啶后啟動堿基切除修復(fù)。

堿基編輯技術(shù)即基于脫氨酶偶聯(lián)鋅指蛋白或TALE。Willis等報道的鋅指-DdCBE即通過改進(jìn)鋅指支架和改造DddA增強活性而來，但脫靶效應(yīng)較為嚴(yán)重。Mok等構(gòu)建的DdCBE可實現(xiàn)mtDNA靶點C-T的轉(zhuǎn)換。Lee等新加入尿嘧啶糖基化酶抑制劑元件保護(hù)尿嘧啶穩(wěn)定存在，其編輯效率提高了8倍。劉如謙團(tuán)隊統(tǒng)計結(jié)果顯示，DdCBE可以修復(fù)49%已知的線粒體有害基因突變；但伊成器團(tuán)隊提出MTS本身的局限性會引起入核脫靶效應(yīng)，TALE存在序列依賴性脫靶編輯。鋅指蛋白CTCF可與凝集蛋白相互作用并參與維持nDNA的三維結(jié)構(gòu)，受CTCF結(jié)合位點共定位干擾，DdCBE還存在TALE序列非依賴性脫靶編輯現(xiàn)象［45］。誠然，使用NES、DddIA、Q1310A突變體等改造手段可減少脫靶效應(yīng)，但MTS導(dǎo)入法也暴露出入核脫靶的風(fēng)險。

綜上，以蛋白質(zhì)作為識別元件的編輯器較為成熟，且在mtDNA編輯中得到一定程度的應(yīng)用，當(dāng)然也存在脫靶效應(yīng)、免疫原性和設(shè)計復(fù)雜等缺陷。隨著技術(shù)不斷迭代升級，鋅指蛋白和TALE技術(shù)的優(yōu)化也趨于飽和，其靶向性已經(jīng)能夠滿足一般需求，研究人員將更關(guān)注對效應(yīng)元件進(jìn)行改造，以增強技術(shù)安全性和正確性。

1.2. 核酸識別序列

1.2.1. CRISPR/Cas9技術(shù) CRISPR/Cas9技術(shù)主要由Cas9蛋白和sgRNA組成。Cas9是一種核酸酶，能夠切割dsDNA，sgRNA能結(jié)合Cas9并特異性識別靶基因，Cas9在sgRNA引導(dǎo)下能特異性切割靶序列［30］。CRISPR系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌用于抵抗外源DNA入侵的免疫系統(tǒng)，由許多短而保守的重復(fù)序列區(qū)和間隔區(qū)組成。重復(fù)序列含有回文序列，可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，間隔區(qū)來源于細(xì)菌捕獲的外源DNA序列，具有特殊性［48］。CRISPR/Cas9技術(shù)主要過程是sgRNA與Cas9結(jié)合改變構(gòu)象，產(chǎn)生DNA通道，Cas9/sgRNA復(fù)合體識別靶鏈PAM區(qū)域促進(jìn)DNA解旋，sgRNA與靶序列互補形成RNA-DNA雜交鏈，Cas9切割靶序列［49］。CRISPR/Cas9本身只介導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，通過NHEJ和HDR等完成基因編輯。

CRISPR/Cas9技術(shù)已被廣泛用于nDNA編輯、產(chǎn)生突變的疾病模型或糾正特定疾病的等位基因，用于mtDNA編輯也如火如荼。Jo等［50］使用mito-Cas9進(jìn)行mtDNA編輯，但觀察到線粒體蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和膜電位遭到破壞。Bian等［51］展示的mito-CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功將一個具有短同源臂的外源單鏈DNA正確地敲入靶位點。Bi等［52］建立的mito-Cas9系統(tǒng)用MTS和3 ´ -UTR有效介導(dǎo)了mRNA的線粒體定位，驗證了mito-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)mtDNA中的同源定向修復(fù)。CRISPR/Cas9是比較成熟的技術(shù)，然而由于核酸導(dǎo)入線粒體尚無高效手段，且線粒體缺乏HDR和NHEJ，在mtDNA編輯領(lǐng)域推廣應(yīng)用仍需繼續(xù)積淀相關(guān)技術(shù)。

1.2.2. 堿基編輯技術(shù) Cas9突變會形成喪失核酸酶活性但保留結(jié)合gRNA能力的dCas9或nCas9蛋白。dCas9能夠融合表達(dá)脫氨酶等多種功能性蛋白，其強大的兼容性在基因編輯領(lǐng)域迅速占據(jù)了一席之地，賊為經(jīng)典的模型便是堿基編輯技術(shù)。Cas9系統(tǒng)擅長基因敲除，對基因插入則略顯乏力，而對于單個堿基的編輯更是束手無策。由于堿基之間的差異往往是氨基、羰基、甲基等的差異，脫氨酶具有更改單個堿基的能力，融合表達(dá)dCas9和脫氨酶從而具有堿基編輯潛能。迄今，已經(jīng)開發(fā)的兩類主要堿基編輯技術(shù)是CBE和ABE，可以有效地介導(dǎo)所有四種可能的轉(zhuǎn)換突變，覆蓋目前已被注釋的人類致病變異的30%［53］。Gaudelli等［54］報道了CBE系統(tǒng)實現(xiàn)C-T或G-A的轉(zhuǎn)換，2017年又開發(fā)了ABE系統(tǒng)實現(xiàn)A-G或T-C的轉(zhuǎn)換［55］，目前通過堿基編輯技術(shù)可將dCas9融合到ssDNA脫氨酶上，在某些情況下，還與操縱DNA修復(fù)機制的蛋白質(zhì)融合。

堿基編輯的多樣性增加了選擇的復(fù)雜性，影響適配性的因素眾多，包括PAM可用性、靶點上下游特征序列、編輯窗口、產(chǎn)品純度和DNA特異性等［56］。核酸識別型的堿基編輯技術(shù)基本沒有用于mtDNA研究，原因在于sgRNA尚不能穩(wěn)定進(jìn)入線粒體。堿基編輯技術(shù)固然具有編輯效率高、損傷少等優(yōu)勢，但仍有可能發(fā)生嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)，如額外產(chǎn)生的旁觀者脫靶效應(yīng)。此外，脫氨酶本身具有潛在的毒性或致癌性。因此，堿基編輯技術(shù)仍有待進(jìn)一步發(fā)展。

1.2.3. PE技術(shù) 鑒于堿基編輯技術(shù)可能觸發(fā)旁觀者脫靶效應(yīng)等，也為了進(jìn)一步增強靶向性，PE技術(shù)應(yīng)運而生。Anzalone等［57］向dCas9系統(tǒng)引入逆轉(zhuǎn)錄酶實現(xiàn)12種單個堿基的轉(zhuǎn)換，降低了脫靶效應(yīng)。PE技術(shù)是結(jié)合Cas9切口酶結(jié)構(gòu)域和工程逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，pegRNA負(fù)責(zé)識別靶點，Cas9切開靶鏈，pegRNA作為模板引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄。新生的ssDNA與原序列競爭結(jié)合引發(fā)DNA修復(fù)。原始鏈傾向于被清除，新片段將優(yōu)先整合入原序列中，實現(xiàn)基因編輯［58］。

PE技術(shù)在nDNA編輯領(lǐng)域發(fā)展顯著：PE1由nCas9與M-MLV RT融合而構(gòu)建；PE2將突變引入M-MLV RT構(gòu)建了五突變體M-MLV RT，其編輯效率提高3倍；PE3使用額外的sgRNA誘導(dǎo)未編輯鏈上的切口以觸發(fā)內(nèi)源性錯配修復(fù)途徑，其編輯效率進(jìn)一步提高2~4倍［57］。Böck等［59］開發(fā)的尺寸減小型SpCas9 PE技術(shù)顯示出治療苯丙酮尿癥的潛力。Petri等［60］則報道了PE技術(shù)通過借助核糖核蛋白復(fù)合體遞送可以提高編輯發(fā)生頻率。

當(dāng)然，PE技術(shù)并非出色，pegRNA的降解會阻礙編輯效率，Nelson等［61］在3 ´ 末端融合了結(jié)構(gòu)化RNA基序增強了其穩(wěn)定性，編輯效率提高了3~4倍。由于RNA接頭具有序列依賴性，他們開發(fā)的pegLIT計算工具（pegRNA接頭識別工具）能減少來自epegRNA接頭干擾。此外，他們發(fā)現(xiàn)使用化學(xué)合成和修飾的epegRNA也能增強效果。PE技術(shù)已在多種人類細(xì)胞系和小鼠神經(jīng)元［62］、胚胎等進(jìn)行了測試，多種哺乳動物細(xì)胞類型均可使用PE技術(shù)，但其效率差異懸殊［57］。后續(xù)研究又發(fā)現(xiàn)DNA錯配修復(fù)會干擾PE發(fā)揮功能，誘導(dǎo)產(chǎn)生多余的插入或缺失副產(chǎn)物。Chen等［63］通過引入MLH1dn開發(fā)出PE4和PE5，瞬時抑制錯配修復(fù)實現(xiàn)更高的編輯效率，相比PE2和PE3分別提升了7.7和2.0倍；對相關(guān)蛋白優(yōu)化后開發(fā)出PEmax，能夠與PE4和PE5系統(tǒng)以及epegRNA協(xié)同作用，其編輯效率提升2.8倍。PE技術(shù)的pegRNA因其兼具了模板功能，相比sgRNA具有更高的復(fù)雜度。而Standage-Beier等［64］開發(fā)的軟件工具PINE-CONE可實現(xiàn)pegRNA和PE技術(shù)策略的自動高通量設(shè)計，提升pegRNA設(shè)計的效率。

PE技術(shù)適用性極度廣泛，PAM與靶點之間的距離更靈活，增強了靶向性。因為逆轉(zhuǎn)錄模板的序列決定了編輯的DNA的序列，因此很少脫靶。當(dāng)然，PE的編輯效率相比之下也略低一些。也有研究人員提出，逆轉(zhuǎn)錄酶可能具有潛在危害，而且PE技術(shù)在不同細(xì)胞類型的兼容性尚未得到廣泛驗證。

1.2.4. pAgo pAgo系統(tǒng)是通過原核細(xì)胞內(nèi)的Argonautes將DNA充當(dāng)引導(dǎo)核酸來行使DNA核酸酶功能。Argonautes是一個多樣化的核酸引導(dǎo)蛋白家族，pAgo利用引導(dǎo)DNA的靶向互補DNA序列保護(hù)宿主免受外源DNA入侵，真核生物Argonautes則與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體參與的RNA干擾具有相關(guān)性。

Ago蛋白一般具有四個結(jié)構(gòu)域，即MID、PIWI、PAZ、N結(jié)構(gòu)域，其結(jié)構(gòu)和功能很保守［65］。MID結(jié)構(gòu)域識別和結(jié)合靶基因，其含有保守芳香族氨基酸或特定環(huán)狀結(jié)構(gòu)的核苷酸結(jié)合口袋，識別5 ´ -磷酸基團(tuán)特定的5 ´ -堿基［66-67］。PIWI結(jié)構(gòu)域類似于核糖核酸酶H的折疊結(jié)構(gòu)，活性位點的DEDX或DDK基序依賴錳離子等二價陽離子協(xié)調(diào)催化［68-70］。PAZ結(jié)構(gòu)域具有序列識別特異性的SH3樣桶折疊結(jié)構(gòu)，與引導(dǎo)鏈3 ´ 端相互作用引導(dǎo)和固定MID，保護(hù)引導(dǎo)核酸不被降解［71-72］，隨后引導(dǎo)鏈與PAZ結(jié)構(gòu)域保守的Arg相互作用啟動堿基配對［73］。N結(jié)構(gòu)域參與靶標(biāo)斷裂，根據(jù)復(fù)合物的狀態(tài)在靶標(biāo)結(jié)合和切割過程中起到楔形作用［74］。楔入機制分為主動楔入和被動楔入，前者通過伴侶機制和ATP水解驅(qū)動直接切割，后者依賴堿基錯配或G·U擺動誘導(dǎo)，無驅(qū)動自發(fā)形成［75-77］。簡而言之，pAgo發(fā)揮功能是通過MID結(jié)構(gòu)域與PAZ結(jié)構(gòu)域?qū)σ龑?dǎo)鏈進(jìn)行識別和固定，誘導(dǎo)引導(dǎo)鏈與靶鏈正確結(jié)合。隨后PIWI結(jié)構(gòu)域發(fā)揮核酸酶功能切割對應(yīng)核酸片段，賊后N結(jié)構(gòu)域以主動楔入或被動楔入的機制順利分離引導(dǎo)鏈。

早期發(fā)現(xiàn)的pAgo來自嗜熱原核生物，如TtAgo（Thermus thermophilus）［78］、PfAgo（Pyrococcus furiosus）［79］、MpAgo（Marinitoga piezophila）［80］和MjAgo（Methanocaldococcus jannaschii）［81］等利用向?qū)NA或gRNA在高溫下切割DNA片段；CbAgo（Clostridium butyricum）［82］、LrAgo（Limnothrix rosea）［82］、SeAgo（Synechococcus elongatus）［83］、KmAgo（Kurthia massiliensis）［84-85］、CpAgo（Clostridium perfringens）［85］和IbAgo（Intestinibacter bartlettii）［85］可以在中等溫度下切割ssDNA或dsDNA，其中來自人腸道細(xì)菌的CpAgo還可以對RNA靶向切割，具有哺乳動物細(xì)胞基因編輯的潛力。Li等［86］報道了進(jìn)步常溫下偏好切割RNA的MbpAgo，這種pAgo從耐寒菌中篩選出來，在4~65 ℃都很活躍。這意味著自然界中也存在種類繁多的能在適宜溫度下發(fā)揮功能的pAgo。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些pAgo能夠被質(zhì)粒衍生出的mRNA引導(dǎo)用于編輯質(zhì)粒DNA，減少報告基因的轉(zhuǎn)錄和質(zhì)粒含量［83］，基于mtDNA與質(zhì)粒DNA在結(jié)構(gòu)上的相似性，這為線粒體編輯提供了新思路。設(shè)計一段具有一定長度的正常mtDNA序列的同源臂以指導(dǎo)新一輪復(fù)制過程中突變DNA序列向正常DNA的轉(zhuǎn)化，有利于通過基因編輯搶救和恢復(fù)受損的線粒體。這種原核細(xì)胞與真核細(xì)胞都相似的系統(tǒng)可能具有更強的兼容性和靶向性，具有線粒體編輯工具開發(fā)的潛能。

綜上，Cas9系列技術(shù)賊為成熟，展示出核酸型識別元件的優(yōu)越性，主要體現(xiàn)在易于設(shè)計和特異性更強，但也存在難以有效遞送進(jìn)入線粒體的致命缺陷。雙鏈斷裂也許并非mtDNA編輯的賊佳手段，堿基編輯技術(shù)和PE技術(shù)正確針對靶向點突變，無需雙鏈斷裂或供體DNA模板或HDR，依托于dCas9或nCas9系統(tǒng)，其靶向原理與Cas9系統(tǒng)具有同質(zhì)性，因此在線粒體中開發(fā)利用的原則也基本一致。gRNA進(jìn)入線粒體的效率是Cas9系列技術(shù)應(yīng)用于mtDNA編輯的關(guān)鍵因素。pAgo展現(xiàn)出ssDNA或RNA指導(dǎo)下的DNA剪切功能，但pAgo的剪切主要針對ssDNA，對基因組的編輯能力有限。同時，pAgo對靶標(biāo)序列無PAM基序等限制，具有更廣泛的編輯潛力。對pAgo作用機制的研究有利于開發(fā)廣譜基因編輯工具和作為CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)展的補充。應(yīng)用于mtDNA同樣需要克服遞送線粒體困難的核酸識別型mtDNA編輯技術(shù)的共性問題。

2. 核酸識別型線粒體DNA編輯技術(shù)的廣闊前景

2.1. 核酸類識別元件的優(yōu)越性

RE、Cas、DddA等主流切割元件本身具有組成性活性，RE和Cas以雙鏈斷裂作為主要編輯手段，但HDR發(fā)生概率低導(dǎo)致插入基因能力也有限。脫氨酶類的切割元件作為細(xì)菌毒素則有潛在致癌性，也有旁觀者脫靶效應(yīng)。

鋅指蛋白、TALE、gRNA、ssDNA等均能充當(dāng)識別元件。鋅指蛋白與TALE同屬于蛋白質(zhì)，鋅指蛋白識別精度相對較差，但一個模塊能夠識別三個特定堿基，這賦予它較小的開放閱讀框負(fù)載。TALE能夠識別單個堿基從而具有更靈活的位點選擇性，但其陣列的分析與構(gòu)建更為復(fù)雜，每次更換位點都需要從頭構(gòu)建，這為研究者帶來了極大的負(fù)擔(dān)，甚至難以得到有效的結(jié)構(gòu)。gRNA作為核酸識別元件具有高度特異性，其易于設(shè)計的特點相比鋅指蛋白和TALE復(fù)雜的結(jié)構(gòu)具有獨特的優(yōu)越性。畢竟無論是RNA或是ssDNA，其基本組成均為四個堿基，而蛋白質(zhì)則含有20種常見氨基酸，后者對算力的需求遠(yuǎn)大于前者。誠然，脫靶效應(yīng)仍是不可避免的，但由于結(jié)構(gòu)簡單，其序列優(yōu)化難度遠(yuǎn)低于蛋白質(zhì)。RNA易降解的特性也許一定程度上限制了使用，但這也避免了細(xì)胞內(nèi)積聚。過量的編輯工具在線粒體中積聚顯然并不合適，更短的半衰期能預(yù)防基因編輯工具過量囤積，線粒體擅長降解修復(fù)的特性可能進(jìn)一步放大基因編輯工具滯留的危害。gRNA和靶DNA形成雙鏈體的穩(wěn)定性可以反映出gRNA的識別效率［87］，相比蛋白質(zhì)這種核酸之間結(jié)合的穩(wěn)定性可能更好。細(xì)胞天然存在DNA-DNA與DNA-RNA組成性配對，而蛋白質(zhì)則需要結(jié)合靶點的實際序列尋找匹配的氨基酸組合。此外，核酸簡單的結(jié)構(gòu)賦予其更易被修飾的特性，具有更大的靈活性。

2.2. 核酸類識別元件的可行性

mtDNA編輯系統(tǒng)需要考慮核酸和蛋白質(zhì)通過線粒體膜的能力，MTS基本解決了鋅指蛋白和TALE等外源蛋白質(zhì)難以進(jìn)入線粒體的問題，但仍然存在入核脫靶現(xiàn)象，需要對各種細(xì)節(jié)優(yōu)化研究。CRISPR技術(shù)在mtDNA編輯領(lǐng)域應(yīng)用不如在nDNA編輯領(lǐng)域，線粒體對gRNA的屏蔽限制了mito-Cas9、線粒體堿基編輯器和PE等mito-CRISPR技術(shù)發(fā)展。mito-CRISPR系統(tǒng)應(yīng)用于mtDNA編輯的賊大瓶頸便是gRNA導(dǎo)入線粒體的機制，一般RNA導(dǎo)入法挽救線粒體僅限于糾正線粒體tRNA突變引起的缺陷，這個過程往往引入外源蛋白質(zhì)因子或?qū)⒍鄟喕奂w移入，效率低下且兼容性較低難以復(fù)制。Wang等［88］設(shè)計的人線粒體tRNA和mRNA可以有效靶向線粒體，賊后通過線粒體中的正常途徑降解。

對RNA導(dǎo)入線粒體內(nèi)在機制的研究有利于推動核酸識別靶點型編輯器在mtDNA中應(yīng)用。RNA的類型具有多樣性，結(jié)構(gòu)也復(fù)雜多變，對特殊RNA的研究逐漸彰顯出優(yōu)越性。Kolesnikova等［89］發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞質(zhì) tRNALysCUU （tRK1）的F臂和D-發(fā)夾結(jié)構(gòu)域具有特殊性；持家基因表達(dá)的烯醇化酶不僅參與糖酵解，還促進(jìn)tRNA靶向線粒體，部分tRNA能夠形成穩(wěn)定的新F臂結(jié)構(gòu)，得以導(dǎo)入線粒體?？紤]到mtDNA能夠編碼tRNA，真核生物tRNA可能存在潛在的線粒體識別區(qū)域，對mtDNA基因編輯技術(shù)發(fā)展具有指導(dǎo)意義。同時，Smirnov等［90］證明了人類5S rRNA通過兩個區(qū)域?qū)崿F(xiàn)線粒體靶向，其中一個位于螺旋Ⅰ的近端，包含一個保守的無補償G：U對，另一個是更重要的環(huán)E-螺旋Ⅳ區(qū)（γ域），而β結(jié)構(gòu)域的缺失不影響功能，因此β域改造后的5S rRNA作為載體具有攜帶外源RNA進(jìn)入線粒體的潛能。此外，lncRNA在細(xì)胞內(nèi)多個結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)并發(fā)揮了重要功能，同樣具有進(jìn)入線粒體發(fā)揮功能的能力。如細(xì)胞膜脂結(jié)合LINK-A促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)膜PIP3-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［91］，細(xì)胞質(zhì)CamK-A介導(dǎo)鈣離子信號與NF-κB信號交互［92］，細(xì)胞核BCAR4介導(dǎo)了Hedgehoge-Hippo信號協(xié)同轉(zhuǎn)錄［93］。Sang等［94］通過繪制細(xì)胞器lncRNA圖譜，揭示了線粒體lncRNA GAS5介導(dǎo)三羧酸循環(huán)代謝區(qū)室解離中的重要調(diào)控作用，具有線粒體定位的GAS5為RNA線粒體定位的內(nèi)源性途徑研究提供了嶄新視角。

tRNA、rRNA與lncRNA均可成功進(jìn)入線粒體，預(yù)示gRNA有通過內(nèi)源性途徑進(jìn)入線粒體的潛能。除此之外，也可通過外源性途徑導(dǎo)入，如納米粒和藥物遞送方法。Yuan等［95］報道了使用可生物降解的二氧化硅納米粒將天然蛋白質(zhì)和抗體遞送到線粒體。Haddad等［96］設(shè)計的靶向線粒體的金屬有機物框架成功將藥物定位于線粒體。外源性途徑導(dǎo)入策略對線粒體基因病的治療策略有一定的借鑒意義。由于mtDNA具有異質(zhì)性，很多時候發(fā)病機制源于突變mtDNA的比例超出閾值，因此通過提高正常mtDNA比例來抑制突變mtDNA發(fā)揮致病性不失為一種治療策略。Kawamura等［97］開發(fā)了線粒體遞送的脂質(zhì)體載體mito-Porter，成功將野生型mtDNA pre-tRNAPhe轉(zhuǎn)染入線粒體tRNA具有G625A異質(zhì)突變的細(xì)胞，經(jīng)過數(shù)輪mtDNA復(fù)制，有效降低了突變mtDNA的比例。當(dāng)然，這種手段不能忽視外源性mtDNA和遞質(zhì)載體潛在的免疫原性，同時mtDNA的遞送手段也是該項技術(shù)的重點和難點。目前，對于線粒體遞送技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，除了基于MTS的生物學(xué)靶向法，還存在親脂性陽離子靶向、物理手段遞送、膜融合脂質(zhì)體等三個分支［98］。親脂性陽離子能夠與強負(fù)電位的線粒體內(nèi)膜相互作用，物理手段包括電穿孔和流體動力注射法等，膜融合脂質(zhì)體則可以順利進(jìn)入線粒體膜間隙或基質(zhì)中。mtDNA的實質(zhì)也是核酸，這些技術(shù)的迅猛發(fā)展逐漸為基于核酸識別靶點的mtDNA編輯技術(shù)開辟了新思路。

2.3. mtDNA修復(fù)機制的特殊性

mtDNA相比nDNA具有更高的突變概率，這與線粒體長期的氧化內(nèi)環(huán)境有關(guān)，活性氧副產(chǎn)物產(chǎn)生和保護(hù)性組蛋白缺乏等因素均促進(jìn)了mtDNA突變，其修復(fù)機制因此也具有一定的特殊性。mtDNA的修復(fù)與nDNA在種類上并無不同，堿基切除修復(fù)、錯配修復(fù)、單鏈斷裂修復(fù)、雙鏈斷裂修復(fù)等基本修復(fù)機制在mtDNA中均有發(fā)現(xiàn)［99］。但在頻率上mtDNA顯著不同，HDR和NHEJ途徑極少發(fā)生，甚至在學(xué)術(shù)界對其是否存在尚無統(tǒng)一定論。多數(shù)情況下，得益于高拷貝數(shù)，mtDNA修復(fù)傾向于直接暴力降解以降低突變mtDNA比例。而即使不使用降解法，主流的修復(fù)機制也是采取堿基切除修復(fù)，如先后發(fā)現(xiàn)的SP-堿基切除修復(fù)［100］和LP-堿基切除修復(fù)［101］。傳統(tǒng)的手段無論是ZFN、TALEN或Cas系統(tǒng)均通過產(chǎn)生雙鏈斷裂引發(fā)mtDNA降解實現(xiàn)突變mtDNA負(fù)荷下降，受限于HDR和NHEJ的缺乏，基于雙鏈斷裂誘導(dǎo)基因插入的編輯技術(shù)顯得后繼乏力。新型的堿基編輯技術(shù)和PE技術(shù)則跳過雙鏈斷裂修復(fù)機制的局限性，堿基編輯技術(shù)利用脫氨酶等直接作用于堿基實現(xiàn)點突變，PE技術(shù)則彌補了堿基編輯技術(shù)旁觀者脫靶效應(yīng)的劣勢，攜帶模板鏈啟動逆轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)點突變，賊終前者通過堿基切除修復(fù)實現(xiàn)基因編輯，后者的修復(fù)機制尚不明確，但與錯配修復(fù)具有強相關(guān)性。

值得注意的是，堿基編輯技術(shù)主要是實現(xiàn)嘌呤或嘧啶的內(nèi)部轉(zhuǎn)換，鳥嘌呤之外的顛換則難度較大，這是由于脫氨酶催化后產(chǎn)生的次黃嘌呤或尿嘧啶被切除后將形成AP位點，堿基切除修復(fù)傾向于填補鳥嘌呤［102-103］。盡管當(dāng)前也有不少顛換型堿基編輯技術(shù)的例子，如Chen等［104］開發(fā)的ACBE-Q可以實現(xiàn)A-C顛換，但其編輯產(chǎn)物的純度偏低。而PE技術(shù)無需理解堿基切除修復(fù)觸發(fā)的堿基插入AP的傾向性，因為PE技術(shù)攜帶模板啟動編輯，但錯配修復(fù)可能會干擾PE技術(shù)產(chǎn)生額外編輯。堿基編輯技術(shù)與PE技術(shù)各有千秋，區(qū)別在于PE技術(shù)通常以核酸作為識別元件而堿基編輯技術(shù)則沒有限制。此外，堿基編輯器需要克服脫氨酶的組成毒性，而PE中逆轉(zhuǎn)錄酶的潛在危害尚未得到有效論證。PE技術(shù)的獨到之處也折射出核酸作為識別元件在基因編輯領(lǐng)域的優(yōu)勢可圈可點，展現(xiàn)出應(yīng)用于mtDNA編輯的前景。

線粒體疾病基因檢測結(jié)果如何獲得有效的治療

mtDNA編輯治療遺傳病的本質(zhì)在于將nDNA編輯工具引入線粒體內(nèi)以發(fā)揮功能。目前，幾乎所有的mtDNA編輯技術(shù)都基于蛋白質(zhì)識別靶點，這主要是因為MTS技術(shù)相對成熟。然而，就識別元件本身而言，核酸實際上比蛋白質(zhì)更適合識別靶點。靶點本身就是一段核酸，因此以核酸去識別具有更強特異性。此外，核酸，尤其是RNA，具有更簡單和柔性的結(jié)構(gòu)，這使得它更易于被設(shè)計、改造和優(yōu)化。RNA的較短半衰期也避免了識別元件在線粒體內(nèi)大量堆積的風(fēng)險。因此，基于核酸識別靶點進(jìn)行mtDNA編輯無疑是一項重大的技術(shù)突破。

然而，核酸識別型mtDNA技術(shù)的發(fā)展面臨著諸多挑戰(zhàn)，尤其是遞送進(jìn)入線粒體的技術(shù)。目前，研究表明tRNA、rRNA和lncRNA等特殊RNA具有內(nèi)源性進(jìn)入線粒體的能力，而陽離子脂質(zhì)體、電穿孔等技術(shù)則提示了核酸外源性導(dǎo)入線粒體的可能性。研究針對線粒體遞送的內(nèi)源或外源性途徑將有助于開發(fā)sgRNA導(dǎo)入線粒體的有效手段，推動CRISPR技術(shù)與mtDNA編輯的結(jié)合。由于mtDNA修復(fù)機制的特殊性，雙鏈斷裂降解修復(fù)的高發(fā)性可能對線粒體造成較大的損傷，而線粒體HDR和NHEJ的缺乏使得基因插入變得困難。堿基編輯技術(shù)和PE技術(shù)具有一定的潛力，但堿基編輯技術(shù)需要克服堿基切除修復(fù)引起的堿基隨機插入，而PE技術(shù)則需要解決錯配修復(fù)引起的錯誤編輯問題。另一種間接插入基因的形式是直接導(dǎo)入野生型mtDNA，但這需要合適的遞送方式。pAgo作為原核生物來源，也許在線粒體內(nèi)具有特殊性，對pAgo的研究也許有助于更深入地理解核酸識別型mtDNA編輯。

綜上所述，mtDNA編輯治療線粒體遺傳病是未來的一個發(fā)展方向，但mtDNA修復(fù)機制的特殊性影響了nDNA編輯技術(shù)的兼容性，而線粒體的天然膜屏障也增加了mtDNA編輯的難度。目前開發(fā)的一些mtDNA編輯技術(shù)主要以蛋白質(zhì)識別靶點為基礎(chǔ)，但核酸識別靶點的高特異性和低復(fù)雜性使其更適用于mtDNA編輯。對內(nèi)源性和外源性遞送途徑的研究無疑會進(jìn)一步提升其潛在的應(yīng)用價值。相信隨著對核酸遞送機制的深入探索，核酸識別型mtDNA編輯技術(shù)有望成為mtDNA編輯的新前沿。