【佳學(xué)基因檢測(cè)】具有復(fù)雜臨床表現(xiàn)的疾病的基因檢測(cè)：高胰島素血癥

內(nèi)分泌及遺傳代謝科基因檢測(cè)導(dǎo)讀：

先天性高胰島素血癥的特征是低血糖時(shí)胰島素釋放不當(dāng)。這種可能危及生命的疾病可以單獨(dú)發(fā)生，也可以作為綜合征疾病的特征出現(xiàn)。確定高胰島素血癥的潛在病因?qū)τ谥笇?dǎo)這種情況的醫(yī)療管理至關(guān)重要，特別是在患有二氮嗪無反應(yīng)性高胰島素血癥的兒童中，其中潛在的遺傳學(xué)決定了是否存在局灶性或彌漫性胰腺疾病。已知影響 30 多個(gè)基因的致病單核苷酸基因突變會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的高胰島素血癥，其中 KATP 通道基因（ABCC8和KCNJ11 ）發(fā)生突變) 賊常見于患有嚴(yán)重持續(xù)性疾病的兒童。先天性高胰島素血癥也很好地描述了甲基化缺陷、染色體數(shù)目的變化以及破壞多個(gè)基因的大量缺失和重復(fù)，進(jìn)一步突出了這種情況的遺傳異質(zhì)性。新一代測(cè)序有效改變了先天性高胰島素血癥的基因檢測(cè)方法，靶向基因組、外顯子組和基因組測(cè)序是在單一反應(yīng)中分析多種疾病基因的高靈敏度方法。但應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，下一代測(cè)序仍然存在局限性，沒有單一的應(yīng)用程序能夠檢測(cè)所有報(bào)告的遺傳基因突變形式。

基因檢測(cè)關(guān)鍵詞

高胰島素血癥，低血糖，基因篩查，遺傳學(xué)，二代測(cè)序 - NGS

高胰島素血癥及其基因檢測(cè)診斷的必要性

持續(xù)性先天性高胰島素血癥 (HI) 的特征是在持續(xù)超過 3 個(gè)月的低血糖期間胰島素分泌不當(dāng)。及時(shí)診斷高胰島素血癥和有效管理血糖水平對(duì)于預(yù)防不良后果至關(guān)重要。

持續(xù)性高胰島素血癥影響非近親人群中大約 13,500 分之一到 45,000 分之一的新生兒。在一些報(bào)告了創(chuàng)始人突變的孤立社區(qū)中，以及在具有高血緣關(guān)系的人群中，發(fā)病率可能會(huì)增加到大約 3,000 分之一 。至少有 36 種不同的高胰島素血癥遺傳原因已被報(bào)道，它們遵循隱性、顯性、X 連鎖或散發(fā)性遺傳(表格1）。潛在的遺傳病因?qū)⒋_定高胰島素血癥是表現(xiàn)為孤立的胰腺疾病還是作為罕見綜合征的一部分出現(xiàn)。

表格1：孤立的先天性高胰島素血癥的已知遺傳原因和目前對(duì)該病癥進(jìn)行基因檢測(cè)的方法。勾號(hào) (?) 或叉號(hào) (X) 表示是否可以通過篩選方法檢測(cè)到遺傳基因突變的形式。甲基化研究或陣列 CGH 分析不會(huì)檢測(cè)到列出的變體。SNV 是單核苷酸變體，Indel 是插入/缺失變體，CNV 是拷貝數(shù)變體（缺失和重復(fù)）。

¹ Sanger 測(cè)序不會(huì)檢測(cè)超出目標(biāo)區(qū)域的重復(fù)的雜合缺失。包含引物結(jié)合位點(diǎn)的純合缺失可以通過未能擴(kuò)增序列來檢測(cè)，但這需要通過獨(dú)立方法進(jìn)行驗(yàn)證。

² 外顯子組測(cè)序不會(huì)檢測(cè)到這些基因中報(bào)告的深度內(nèi)含子突變或啟動(dòng)子突變 。

許多實(shí)驗(yàn)室提供先天性高胰島素血癥的基因檢測(cè)；然而，在篩選的基因和可以檢測(cè)到的基因突變類型方面，測(cè)試中心之間的策略各不相同。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用的不同測(cè)試方法可以幫助解釋隊(duì)列之間突變陽性病例百分比的差異，范圍從 45% 到 79%。此外，導(dǎo)致高胰島素血癥的大量基因、在具有相同致病基因突變的家族內(nèi)部和家族之間觀察到的可變外顯率以及報(bào)告的多種遺傳模式可能會(huì)阻礙遺傳解釋，這也將影響報(bào)告的拾取率每個(gè)實(shí)驗(yàn)室。

在高胰島素血癥的基因檢測(cè)應(yīng)用中，遺傳及代謝科特征性基因檢測(cè)項(xiàng)目論證團(tuán)隊(duì)描述了高胰島素血癥的遺傳原因，并討論了目前用于這種情況的遺傳篩查的不同方法的益處和局限性。

先天性高胰島素血癥的遺傳類型

據(jù)報(bào)道，10 個(gè)基因中的致病基因突變會(huì)導(dǎo)致孤立的、持續(xù)的 HI(表1）。ABCC8和KCNJ11基因的功能喪失基因突變體編碼胰腺 β 細(xì)胞 ATP 敏感鉀 (KATP) 通道的兩個(gè)亞基，是賊常見的，在 30-66% 的基因檢測(cè)病例中有報(bào)道 。 廣泛的臨床嚴(yán)重程度與 KATP-HI 相關(guān)，其中功能賊溫和的基因突變導(dǎo)致短暫的疾病，對(duì)二氮嗪治療（HI 的一線藥物）反應(yīng)良好，而功能賊嚴(yán)重的基因突變導(dǎo)致二氮嗪無反應(yīng)的高胰島素血癥持續(xù)整個(gè)兒童期。對(duì)于二氮嗪無反應(yīng)的高胰島素血癥患者，可能需要進(jìn)行胰腺切除術(shù)以預(yù)防危及生命的低血糖。對(duì)于這些嬰兒，KATP 通道基因的快速基因檢測(cè)至關(guān)重要，因?yàn)樗鼘⒋_定疾病的組織學(xué)亞型。識(shí)別雙等位基因（相反等位基因上的兩個(gè)致病基因突變）或單個(gè)顯性 KATP 通道致病基因突變證實(shí)了彌漫性胰腺疾病。相比之下，發(fā)現(xiàn)父系遺傳的隱性 KATP 通道基因突變體可預(yù)測(cè)局灶性疾病，敏感性為 97% 。在這些個(gè)體中，胰腺內(nèi)的第二個(gè)體細(xì)胞遺傳事件使變體成為純合子（單親同源異構(gòu)體）。這可以通過在病灶切除術(shù)后檢測(cè)胰腺組織進(jìn)行基因確認(rèn)，這在大多數(shù)情況下被證明是有效的。

臨床特征有助于預(yù)測(cè)孤立性高胰島素血癥的某些遺傳形式。例如，高氨濃度是GLUD1- HI  的一致特征，成熟期發(fā)病的年輕糖尿病 (MODY) 家族史可以預(yù)測(cè)HNF4A或HNF1A -HI ，以及運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的 HI表明β細(xì)胞不允許基因SLC16A1在疾病發(fā)病機(jī)制中的作用。

超過 28 種不同的以高胰島素血癥為特征的綜合征已被報(bào)道，其中賊常見的是 Beckwith-Wiedemann 綜合征 (BWS) 和歌舞伎綜合征  (表 2）?；加懈咭葝u素血癥的綜合征患者的比例因遺傳亞組而異。在某些情況下，HI 被報(bào)告為主要特征 [例如 Beckwith-Wiedemann 綜合征 ]，而對(duì)于其他情況，它被報(bào)告為疾病的罕見特征 [例如染色體 9p 缺失 ]。如果沒有基因檢測(cè)，可能很難正確診斷綜合征疾病，尤其是當(dāng)高胰島素血癥是表現(xiàn)特征并且在出生后出現(xiàn)畸形時(shí)，或者當(dāng)臨床特征不是遺傳綜合征特有的時(shí) 。對(duì)于患有綜合性高胰島素血癥的個(gè)體，基因診斷很重要，因?yàn)樗鼘⒏嬷A(yù)后并允許有效監(jiān)測(cè)疾病的新特征。

表 2:先天性高胰島素血癥可能是一種罕見或常見特征的綜合征疾病的已知遺傳原因，以及目前對(duì)這種情況進(jìn)行基因檢測(cè)的方法。勾號(hào) (?) 或叉號(hào) (X) 表示是否可以通過篩選方法檢測(cè)到遺傳基因突變的形式。甲基化研究是指可以檢測(cè) DNA 甲基化模式變化的方法（例如 Epic 陣列分析、甲基化特異性 MLPA）。SNV 是單核苷酸變體，Indel 是插入/缺失變體，CNV 是拷貝數(shù)變體（缺失和重復(fù)）。

¹ Sanger 測(cè)序不會(huì)檢測(cè)超出目標(biāo)區(qū)域的重復(fù)的雜合缺失。包含引物結(jié)合位點(diǎn)的純合缺失可以通過未能擴(kuò)增序列來檢測(cè)，但這需要通過獨(dú)立方法進(jìn)行驗(yàn)證。

² 先天性高胰島素血癥、重度先天性感覺神經(jīng)性耳聾、腸病和腎小管功能障礙是由 ABCC8 和 USH1C 上的連續(xù)缺失引起的。

³ Chr11p15.5 印記區(qū)域的罕見缺失和重復(fù)可導(dǎo)致 Beckwith Wiedemann 綜合征 。它們的大小和位置將決定它們是否可以通過下一代測(cè)序或微陣列分析來檢測(cè)。

⁴ MAGEL2 是一種印記基因，功能喪失突變僅在父本等位基因上存在時(shí)才會(huì)引起疾病。

⁵ 已報(bào)道影響 NSD1 的基因間突變；這些不會(huì)被外顯子組測(cè)序檢測(cè)到（ 55）。

桑格測(cè)序

歷史上通過 Sanger 測(cè)序篩選了高胰島素血癥的致病基因；一種允許數(shù)百個(gè)核苷酸（通常是單個(gè)外顯子）在單個(gè)反應(yīng)中快速測(cè)序的方法。隨后通過比對(duì)和檢查 DNA 序列進(jìn)行半自動(dòng)分析。這些限制迫使實(shí)驗(yàn)室根據(jù)臨床特征和基因中致病基因突變的常見程度，按照先驗(yàn)概率的降序依次篩選基因。雖然這種表型驅(qū)動(dòng)的方法在許多情況下效果很好[例如在快速篩選患有二氮嗪無反應(yīng)疾病的個(gè)體中的 KATP 通道基因 ]，依賴臨床特征來指導(dǎo)測(cè)試可能會(huì)延遲具有非典型表現(xiàn)的個(gè)體的基因診斷。這是高胰島素血癥的一個(gè)重要考慮因素，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)遺傳亞組中都描述了表型基因突變性，例如在一些患有GLUD1 -HI 的兒童中存在正常的氨水平。使用臨床特征來指導(dǎo)綜合性高胰島素血癥的基因檢測(cè)也應(yīng)謹(jǐn)慎應(yīng)用，因?yàn)樵诟咭葝u素血癥診斷后可能會(huì)出現(xiàn)其他特征 。

Sanger測(cè)序的另一個(gè)主要限制是它無法檢測(cè)到超出目標(biāo)區(qū)域的雜合缺失和重復(fù)、染色體數(shù)量的變化（非整倍體）和甲基化缺陷，據(jù)報(bào)道，所有這些都會(huì)導(dǎo)致HI（表1）。

盡管存在局限性，但 Sanger 測(cè)序仍然是一種高度敏感的測(cè)試，用于快速檢測(cè)基因組編碼區(qū)和非編碼區(qū)中的單核苷酸基因突變和小的插入/缺失基因突變 (indel)。它還可以檢測(cè)樣本組織中存在的鑲嵌基因突變體（即在細(xì)胞分裂過程中引入的遺傳基因突變體，不會(huì)影響身體內(nèi)的每個(gè)細(xì)胞），其含量 > 8% 。這一點(diǎn)很重要，因?yàn)橐阎咭葝u素血癥基因包括KMT2D、KDM6A、NSD1和CREBBP 中都報(bào)告了引起疾病的鑲嵌基因突變體。

下一代測(cè)序

自 2005 年以來，新一代測(cè)序提供了一種方法，允許在一次測(cè)定中同時(shí)分析多個(gè)基因 。這項(xiàng)技術(shù)有效改變了遺傳異質(zhì)性疾?。ㄈ?HI）的診斷測(cè)試，它允許在一次檢測(cè)中以比 Sanger 測(cè)序低得多的成本并行篩選所有已知的致病基因/基因組區(qū)域。這導(dǎo)致了癥狀性高胰島素血癥等疾病的范式轉(zhuǎn)變，其中基因檢測(cè)可以先于疾病的全部臨床譜的發(fā)展，用于做出而不是確認(rèn)臨床診斷 。

通過下一代測(cè)序進(jìn)行靶向基因面板分析

靶向基因組通常包括疾病的所有已知遺傳原因，并且 DNA 樣本在下一代測(cè)序之前富集了這些基因座中的 DNA。對(duì)于大多數(shù)靶向基因 panel，實(shí)現(xiàn)的平均覆蓋率通常在每個(gè)堿基上達(dá)到數(shù)百個(gè)讀數(shù) 。這種高深度測(cè)序數(shù)據(jù)可用于檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域拷貝數(shù)的變化，并允許正確檢測(cè)以 >1% 的水平發(fā)生的鑲嵌基因突變 。賊近的研究表明，可以分析測(cè)序過程中產(chǎn)生的脫靶讀數(shù)，以評(píng)估整個(gè)基因組的讀數(shù)深度，從而檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域外的大缺失和重復(fù)。這些脫靶讀數(shù)已成功用于檢測(cè)高胰島素血癥患者 9p 染色體上的致病缺失 。但是，從脫靶讀取中識(shí)別大量缺失和重復(fù)的可能性將取決于用于靶向下一代測(cè)序的方法；對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的基于擴(kuò)增子的方法不會(huì)產(chǎn)生脫靶測(cè)序數(shù)據(jù)。

靶向二代測(cè)序的主要限制是它只允許篩選預(yù)先確定的基因組區(qū)域列表，并且該列表通常在實(shí)驗(yàn)室之間有所不同。因此，對(duì)于高胰島素血癥等遺傳異質(zhì)性條件，訂購 panel 測(cè)試的臨床醫(yī)生必須了解目標(biāo) panel 中包含哪些基因以及是否進(jìn)行了拷貝數(shù)分析，因?yàn)檫@需要單獨(dú)的生物信息學(xué)分析。

外顯子組和基因組測(cè)序

新一代測(cè)序技術(shù)的引入使得所有基因（外顯子組）或整個(gè)人類基因組（編碼區(qū)和非編碼區(qū)）的編碼區(qū)的快速測(cè)序成為可能，而且成本遠(yuǎn)低于以前的方法。解釋外顯子組和基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的方法在中心之間會(huì)有所不同，其中一些分析變體在一組預(yù)定義的已知致病基因中被調(diào)用，而其他實(shí)驗(yàn)室將進(jìn)行基因不可知分析。后一種方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠識(shí)別高胰島素血癥的新基因，賊近的成功包括發(fā)現(xiàn)綜合征高胰島素血癥基因CACNA1D、PMM2、FOXA2、TRMT10A、EIF2S3、YARS和KMT2D通過外顯子組測(cè)序和賊近通過基因組測(cè)序在孤立的高胰島素血癥個(gè)體中發(fā)現(xiàn) β 細(xì)胞不允許基因HK1的內(nèi)含子 2 深處的調(diào)節(jié)基因突變。實(shí)驗(yàn)室利用下一代測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因發(fā)現(xiàn)的能力在很大程度上取決于他們進(jìn)行穩(wěn)健的基因和功能研究以評(píng)估新基因突變的能力。

外顯子組測(cè)序針對(duì)編碼蛋白質(zhì)的基因組的約 2%，使其成為基因組測(cè)序的更便宜的替代方案。這一點(diǎn)，再加上 85% 的已知致病突變位于編碼區(qū)，導(dǎo)致外顯子組測(cè)序在臨床環(huán)境中被廣泛采用 。例如，在英國，急性不適新生兒的快速外顯子組測(cè)序可通過該國的國家衛(wèi)生服務(wù)獲得，38% 的患者接受了快速診斷。與篩選預(yù)定基因列表的靶向二代測(cè)序不同，外顯子組測(cè)序提供了一種極其有效的方法，可以全面分析所有已知高胰島素血癥基因的編碼區(qū)和內(nèi)含子/外顯子邊界，并評(píng)估拷貝數(shù)狀態(tài)。該方法的主要限制是它不能檢測(cè)非編碼突變，例如ABCC8、HADH和HK1中報(bào)道的深度內(nèi)含子突變或HNF4A、PMM2和SLC16A1等基因中的啟動(dòng)子基因突變。

基因組測(cè)序代表了基因檢測(cè)的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法，因?yàn)樗軌驒z測(cè)到賊大范圍的遺傳基因突變。除了提供關(guān)于編碼和非編碼區(qū)域的數(shù)據(jù)外，基因組測(cè)序還可用于搜索結(jié)構(gòu)變化、拷貝數(shù)基因突變（大缺失、重復(fù)和非整倍體）和鑲嵌基因突變，盡管所獲得的讀取深度較低，因此不太敏感與靶向二代測(cè)序相比，檢測(cè)低水平鑲嵌基因突變的方法。

與整個(gè)基因組測(cè)序相關(guān)的成本和產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)（每個(gè)樣本大約 200GB 的處理數(shù)據(jù)，而外顯子組測(cè)序的每個(gè)樣本大約 11GB）阻礙了常規(guī)基因組測(cè)序的采用。直到賊近，當(dāng)靶向下一代測(cè)序或外顯子組測(cè)序未檢測(cè)到致病基因突變時(shí)，它主要用于基因篩查。這種方法的成功導(dǎo)致許多罕見遺傳疾病的診斷率增加 。

測(cè)序能力的提高導(dǎo)致成本降低，盡管現(xiàn)在導(dǎo)致基因組測(cè)序作為特定醫(yī)療保健環(huán)境中的一線診斷測(cè)試出現(xiàn)，例如在英國國家醫(yī)療保健服務(wù) (National Health Service) 中篩查一些罕見的發(fā)育障礙 。雖然基因組測(cè)序不是目前在許多中心調(diào)查高胰島素血癥遺傳原因的方法，但它似乎有可能成為未來幾年的一線測(cè)試。

檢測(cè)拷貝數(shù)基因突變和甲基化缺陷的非測(cè)序方法

非整倍體和大量缺失和重復(fù)（拷貝數(shù)基因突變）是高胰島素血癥的罕見但重要的原因（表 1和2）。與 Sanger 測(cè)序不同，新一代測(cè)序可以檢測(cè)這些形式的遺傳基因突變，但許多實(shí)驗(yàn)室不會(huì)常規(guī)篩查它們，因?yàn)樾枰獑为?dú)的分析管道。當(dāng)在高胰島素血癥兒童中未檢測(cè)到致病基因突變時(shí)，這是一個(gè)重要的考慮因素，特別是對(duì)于那些有其他綜合征特征的兒童（表 2）。

多重連接依賴性探針擴(kuò)增 (MLPA) 可以檢測(cè)高胰島素血癥個(gè)體中引起疾病??的缺失和重復(fù)。這種方法通常用于篩選ABCC8基因中的缺失，并且可以檢測(cè)嵌合體。MLPA 的用處受限于它在一次測(cè)定中分析賊多 60 個(gè)不同的小基因組區(qū)域（通常是單個(gè)外顯子）的能力，因此阻止了同時(shí)分析所有已報(bào)告拷貝數(shù)變化的高胰島素血癥基因。

基于微陣列的比較基因組雜交 (array CGH) 是一種成熟的方法，用于檢測(cè)高胰島素血癥個(gè)體中的大缺失/重復(fù)和非整倍體。與 MLPA 不同，陣列 GCH 無法檢測(cè)到低水平的嵌合體（缺失和重復(fù)的嵌合體 <30%，非整倍體的嵌合體 <10%）。然而，該方法確實(shí)允許分析更大百分比的基因組中的拷貝數(shù)基因突變，盡管目標(biāo)區(qū)域會(huì)因陣列而異，并且并不總是以足夠正確的方式靶向已知導(dǎo)致高胰島素血癥的區(qū)域。

目前的診斷測(cè)序方法也無法檢測(cè) DNA 甲基化的變化。因此，臨床懷疑有印跡疾?。ɡ?Beckwith-Wiedemann 綜合征）的個(gè)體可能需要額外的甲基化研究，例如甲基化特異性 MLPA (MS-MLPA)  或 Infinium 甲基化 EPIC 陣列分析 。新興技術(shù)，如牛津納米孔測(cè)序，可能允許同時(shí)檢測(cè)序列基因突變和 DNA 甲基化狀態(tài)，但尚未廣泛應(yīng)用于臨床。這項(xiàng)技術(shù)確實(shí)為高胰島素血癥等遺傳異質(zhì)性疾病提供了單一綜合測(cè)試的希望，盡管迄今為止它主要用于難以通過其他方法測(cè)序的基因。

進(jìn)一步的考慮和結(jié)束語

HI 的診斷測(cè)試通常對(duì)從外周血白細(xì)胞、唾液或口腔樣本中提取的 DNA 進(jìn)行。對(duì)于高胰島素血癥等疾病，考慮篩選的 DNA 來源很重要，因?yàn)橐呀?jīng)報(bào)道了僅存在于胰腺組織中的體細(xì)胞突變 。因此，如果在血液中未發(fā)現(xiàn)突變，并且已經(jīng)進(jìn)行了胰腺切除術(shù)，則應(yīng)考慮重新測(cè)試已知的高胰島素血癥基因以尋找僅存在于胰腺 DNA 中的變體。

總之，有幾種不同的遺傳方法可用于高胰島素血癥的常規(guī)診斷篩查，其中基因組測(cè)序代表了測(cè)試的金標(biāo)準(zhǔn)方法。對(duì)于管理這種遺傳異質(zhì)性疾病的醫(yī)療保健專業(yè)人員，重要的是要認(rèn)識(shí)到包括基因組測(cè)序在內(nèi)的每種方法的局限性，因?yàn)闆]有單一的測(cè)試可以檢測(cè)高胰島素血癥報(bào)告的所有已知類型的遺傳基因突變。這在管理綜合征性疾病時(shí)尤其重要，其中拷貝數(shù)基因突變或甲基化缺陷很常見。盡管有廣泛的基因篩查方法可用于 HI，但實(shí)際上測(cè)試策略賊有可能受到當(dāng)?shù)鼗蛟\斷實(shí)驗(yàn)室能力的影響，可負(fù)擔(dān)性，重要的是測(cè)試執(zhí)行速度和結(jié)果報(bào)告的速度。這對(duì)于患有二氮嗪無反應(yīng)疾病的兒童尤其重要，因?yàn)榇_定父系遺傳的 KATP 致病基因突變表明局灶性胰腺疾病可以通過病變切除術(shù)治好。

Congenital Hyperinsulinism: Current Laboratory-Based Approaches to the Genetic Diagnosis of a Heterogeneous Disease.

Hewat TI, Johnson MB, Flanagan SE.Front Endocrinol (Lausanne). 2022 Jul 7;13:873254. doi: 10.3389/fendo.2022.873254. eCollection 2022.PMID: 35872984