【佳學基因檢測】NANA貯積病基因檢測

 

NANA貯積病基因檢測患者介紹

2020年12月，一個來自河北的男孩，在兒科遺傳病專家會診的建議下，來到佳學基因進行咨詢。這個男孩是一對經(jīng)過親緣關(guān)系基因檢測后確定沒有血親的父母所生的第一個孩子。除了母親在懷孕第 7 個月期間描述說存在暫時性胎動減少外，懷孕期間平安無事。男嬰孕37周后出生，出生體重2630克，身長49厘米，頭圍32厘米。 Apgar 評分為 10-10-10，圍產(chǎn)期無并發(fā)癥。由于雙側(cè)內(nèi)斜視，這名男孩在 9 個月大時新穎入院。然后他還被發(fā)現(xiàn)患有遠視（+7-8）。定期眼科檢查未發(fā)現(xiàn)其他變化。由于精神運動發(fā)育遲緩，他在 13 個月大時再次入院。他可以坐著，用他的整只手抓住并在它們之間移動，并用兩個音節(jié)喋喋不休，對應(yīng)于大約 6-7 個月的發(fā)育年齡。肌張力和腱反射正常。他在 3 歲左右學會了說幾句話和獨立行走。他的溝通能力在 5 歲時達到頂峰，當時他可以組合 2-3 個單詞，而他的最佳運動功能是在 9 歲時，當時他可以在沒有支撐的情況下上下坡。從那以后，他慢慢失去了發(fā)育技能，變得越來越僵硬。左旋多巴治療試驗沒有效果。由于吞咽困難，他在 11 歲時接受了有效性胃造口術(shù)，盡管他仍然能夠自己吃小塊食物。在 16 歲的最后一次評估中，他是一個非?？鞓泛碗S和的年輕人，能夠通過手勢、聲音、指點和大約 30 個手勢和幾句話進行交流。他能夠在支持下行走約 100 米，并且具有相對良好的雙側(cè)鉗抓精細運動功能。檢查時，他的肌張力普遍增加，被認為是痙攣和強直的混合體，伴有大關(guān)節(jié)攣縮和右側(cè)脊柱側(cè)凸。肌腱反射通常隨著左側(cè)踝陣攣和右側(cè) Babinski 征而增強。沒有不自主運動或共濟失調(diào)跡象。他沒有癲癇發(fā)作，腦電圖也正常。頭圍和身高一直正常，沒有其他器官受累的跡象。包括代謝篩查分析在內(nèi)的常規(guī)實驗室檢查是正常的。在 8 歲時對大腦進行了 3 T MRI，顯示出髓鞘形成不足和胼胝體變薄的輕度特征（圖 1）。鑒于不尋常的表型，對 SLC17A5 功能的進一步分析表明是由尿液和成纖維細胞中游離唾液酸的升高驅(qū)動的。 軸位 T2 序列顯示幕上中央白質(zhì) (a) 的 T2 信號略有增加，而小腦白質(zhì)看起來正常 (b)。 軸位 T1 加權(quán)成像顯示幕上白質(zhì)信號正常（c）。 矢狀位 T2 加權(quán)成像顯示胼胝體有點薄，松果體有一個小囊腫（1.2 厘米）(d)
 

NANA貯積病基因檢測患者的生化分析樣本

根據(jù)常規(guī)程序獲得皮膚成纖維細胞，并在補充有 10% 胎牛血清和 1% PEST 的 Eagle 最低限度必需培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過胰蛋白酶消化收集匯合的細胞并儲存在-20℃直至分析。
尿液樣本作為早晨等分試樣收集并儲存在-20°C直至分析。
 

NANA貯積病基因檢測患者的唾液酸分析

將成纖維細胞懸浮在水中并使用玻璃/聚四氟乙烯勻漿器勻漿。添加氯化鈉至終濃度為 0.15 M 后，將細胞在 +4 °C 下以 20 000xg 離心 30 分鐘，收集上清液用于測定游離唾液酸。細胞蛋白濃度通過 BCA 方法（Pierce 實驗室）測定。通過薄層色譜分析尿液中的游離唾液酸。板在 1-丁醇/乙酸/水（2:1:1 體積比）中顯影，并用間苯二酚試劑顯影。在用 0.05 M 硫酸水解并用離子交換色譜純化后，使用間苯二酚法測定尿液中的總（游離和結(jié)合）唾液酸。尿液和成纖維細胞中的游離唾液酸在離子交換色譜純化后，根據(jù) Aminoff [10] 的硫代巴比妥酸法進行分析。
 

NANA貯積病基因檢測患者基因檢測中的SLC17A5的Sanger測序

使用 ABI 3730XL 自動測序儀（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）通過 Sanger 測序?qū)?SLC17A5 的所有編碼外顯子（包括外顯子前后的 30 個核苷酸）進行突變分析。使用 SeqPilot 軟件（版本 4.2.1 build 506；JSI medical systems GmbH，Ettenheim，德國）分析數(shù)據(jù)。
 

NANA貯積病基因檢測患者的全外顯子組測序基因檢測

鑒于唾液酸的輕度升高和 SLC17A5 編碼外顯子的初始 Sanger 測序結(jié)果，懷疑是一種新的先天性代謝錯誤，因此通過神經(jīng)科致病基因鑒定基因解碼項目進行了全外顯子組測序（WES） H12-00067）。使用 Agilent SureSelect 試劑盒和 Illumina HiSeq 2000（Perkin-Elmer，美國）對患者及其未受影響的父母進行了 WES基因解碼基因檢測。使用佳學基因的半自動生物信息學分析方案分析數(shù)據(jù)。簡而言之，將測序讀數(shù)與人類參考基因組版本 hg19 進行比對，并鑒定和評估稀有變異體破壞蛋白質(zhì)功能的潛力，隨后在一系列遺傳模型下進行篩選：純合子、半合子、復合雜合子和新發(fā)突變。
 

NANA貯積病基因檢測患者的SLC17A5 RNA/cDNA 檢測

使用 AllPrep DNA/RNA Mini 試劑盒 (Qiagen) 從培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞中提取總 RNA。 RT-PCR 使用一步式 RT-PCR 試劑盒 (Qiagen) 進行，正向引物 5'-TATTCCTGGTAGCTGCTGGC-3' 和反向引物 5'-TCTGGCAACTAGTGATATTTCATGA-3' 預測擴增長度為 517 bp 的產(chǎn)物 NM_012434.4; SLC17A5 cDNA (c.1130 – c.1646)。
 
PCR 產(chǎn)物在用 GelStar® 染色的瓊脂糖凝膠上分離，并在 Dark Reader 藍光透照儀上顯現(xiàn)。使用 ABI PRISM® 3100 基因檢測儀和 BigDye Terminator v.1.1 循環(huán)測序試劑盒（Applied Biosystems）進行測序分析檢測。
 
NANA貯積病基因檢測患者的基因組 DNA 的 PCR 和 Sanger 測序
使用 SLC17A5 DNA 參考序列（Ensembl 基因 ID ENST00000355773）設(shè)計引物。使用跨越可疑插入位置的引物進行初始遠程 PCR（正向引物：5' - CTT CTG GAT TTA GCA TCA ACC A - 3' 和反向引物：5' - AGT ATT CCT GGT AGC TGC TG – 3').所得 PCR 產(chǎn)物用作以下嵌套 PCR 的模板：
 
1）長距離 PCR（正向引物：5' - CTT CTG GAT TTA GCA TCA ACC A - 3' 和反向引物：5' - CAA CTT CCT GCT TTA ATT ATT GTG – 3'）以確定所識別的位置和序列使用 Sanger 測序插入
2）基于 PCR 的測定，使用插入外的兩個引物確認插入的存在/不存在（正向引物：5' - CTT CTG GAT TTA GCA TCA ACC A - 3' 和反向引物：5' - CAA CTT CCT GCT TTA ATT ATT GTG – 3') 和位于插入內(nèi)部的第三個引物（正向引物：5' - AAT ATT CGG GTG GGA GTG AC – 3'）。
使用 BigDye® Terminator v3.1 循環(huán)測序化學（Life Technologies）進行 Sanger 測序，隨后使用 Prism 3130xl 16 毛細管自動遺傳分析儀（Applied Biosystems）通過 CMMT/CFRI DNA 測序核心設(shè)施進行毛細管電泳。使用 (i) RepeatMasker [12] 和 (ii) NetGene2 [13] 和替代剪接位點預測器 (ASSP) [14] 進行計算機分析以確定轉(zhuǎn)座子的類別和對剪接的影響。
 

NANA貯積病基因檢測結(jié)果——唾液酸

在患者 11 歲時進行了兩次唾液酸（總和游離）分析（表 1)。雖然尿液中的總唾液酸接近正常，但薄層色譜顯示異常模式，含有大量游離唾液酸。隨后的定量分析顯示尿液和成纖維細胞中的游離唾液酸含量升高（表1).

表1：尿液和成纖維細胞中的唾液酸

分析物	樣品 1	樣品 2	普通范圍
唾液酸（總計）——尿 nmol/mol 肌酐	68	69	31–69
唾液酸（游離）尿液 nmol/mol 肌酐	60	57	7–21
唾液酸（游離）成纖維細胞 nmol/mg 蛋白質(zhì)	16	-	<1,3

NANA貯積病基因檢測結(jié)果——SLC17A5編碼區(qū)的 Sanger 測序

在為節(jié)省檢測費用而在其他機構(gòu)進行的SLC17A5基因檢測時，對編碼區(qū)進行了 Sanger 測序，沒有找到任何致病基因突變，此時，也沒有對外顯子 9 進行測序。

NANA貯積病基因檢測結(jié)果——全外顯子組測序

使用佳學基因致病基因鑒定基因解碼生物信息學方法時，確定了 20 個受罕見變異影響的候選基因，這些變異預計會影響蛋白質(zhì)功能并根據(jù)孟德爾遺傳模型進行分離。根據(jù)遺傳模式，這些可分為：純合子（SPTY2D1、LRP2和ERCC5）、半合子（FLNA、ZNF275、GRIPAP1、AMER1、PLXNB3、TAS2R43、ARSH、MAGEA11和NLGN4X）、復合雜合子（PLXND1、NHSL1、COBL、PIEZO1、NUP153和MYH7B）和新發(fā)突變（TCTE1和PUSL1）。然而，這些候選基因中沒有一個可以合理地假設(shè)導致該指數(shù)的生化和臨床表型。有趣的是，除此之外，WES 分析還揭示了在SLC17A5的內(nèi)含子 9 中存在指示大小和來源未知的純合子錯配簇的存在，斷點之一位于距內(nèi)含子/外顯子邊界 24 bp 處。鑒于先前描述的SLC17A5中的 Salla 致病變異譜并且外顯子 9 無法通過 Sanger 測序擴增，因此基因解碼分析該插入突變是最佳候選位點并被進一步分析。

NANA貯積病基因檢測結(jié)果——SLC17A5 RNA/cDNA 分析

來自培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞的SLC17A5 cDNA的 RT-PCR ，跨越 cDNA c.1130 – c.1646，隨后進行凝膠電泳，揭示了三種產(chǎn)物，而不是患者中預期的 517 bp 單一轉(zhuǎn)錄本，但對照受試者中沒有（圖 2A). 一個附加片段約為 620 bp，另一個約為 1000 bp。所有三個條帶均被切下并通過 Sanger 測序進行測序。620 bp 片段的測序分析顯示插入長度為 106 bp，其中前 24 bp 對應(yīng)于緊鄰外顯子 9 剪接位點的內(nèi)含子序列，隨后是對應(yīng)于先前描述的位置 6033-5952 的 82 bp 序列轉(zhuǎn)座因子KF425758.1 （圖 2b). 由于噪音和背景太多，來自 > 1000 bp 產(chǎn)品分析的測序數(shù)據(jù)不可讀。517 bp 的產(chǎn)物對應(yīng)于患者和對照（未顯示）的參考序列NM_012434.4。

 
 
圖 2:基因檢測分析。從培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞中提取 RNA ，RT-PCR 隨后對跨越SLC17A5基因中 cDNA 位置 c.1130 – c.1646 的產(chǎn)物進行凝膠電泳，顯示除了患者預期的 517 bp 片段之外還有兩個異常大小的額外片段。對照樣本 ( a )中不存在異常轉(zhuǎn)錄本。620 bp 片段的直接測序顯示長度為 106 bp 的明顯純合插入，其中前 24 bp 對應(yīng)于緊鄰外顯子 9 剪接位點的內(nèi)含子序列，隨后是對應(yīng)于 6033-5952 位點的 82 bp 序列轉(zhuǎn)座因子KF425758.1 ( b )

NANA貯積病基因檢測結(jié)果——基因組 DNA 的 PCR 和 Sanger 測序基因檢測

隨后對通過外顯子組測序和 RNA/cDNA 分析鑒定的區(qū)域進行 Sanger 測序，證實存在 6040 bp 插入，該插入位于SLC17A5的內(nèi)含子 9 （外顯子 9 下游 24 bp）（圖 3a). RepeatMasker 分析顯示該插入是一個長散布元素 1 (LINE-1, L1) 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。正如基于外顯子組測序數(shù)據(jù)和 RT-PCR 分析所預期的那樣，該插入是純合的，而未受影響的父母是雜合的（圖  3b).

 
 
圖 3：這個 ~6 kb 片段的測序證實了 6040 bp LINE-1 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的存在，它被插入到內(nèi)含子 9 ( a ) 中。PCR 分析證實未受影響的父母對于此插入是雜合的，而患者是純合的 ( b )
除了位于外顯子-內(nèi)含子邊界的預測剪接位點之外，使用 NetGene2 進行的剪接位點分析還揭示了插入 82 bp 處的另一個預測剪接位點，而 ASSP 分析確定了插入 679 bp 處的第三個預測剪接位點（圖. 4a). 由三個預測的剪接位點創(chuàng)建的轉(zhuǎn)錄本將擴增一個 517 bp 片段（野生型）、一個 623 bp 片段和一個 1220 bp 片段，與 cDNA 分析一致。來自這兩個交替剪接位點的產(chǎn)物導致移碼，導致提前終止密碼子 4 bp 進入內(nèi)含子 9。在翻譯異常轉(zhuǎn)錄本的情況下，提前終止將在氨基酸 421（圖  4b)。
 
圖 4：使用 NetGene2 和 ASSP 進行的剪接位點分析表明，在存在插入的情況下，除了出現(xiàn)在外顯子內(nèi)含子邊界的正確剪接位點之外，插入中還存在另外兩個剪接位點 ( a )。這些交替剪接事件導致移碼突變，從而導致氨基酸 421 處的過早終止密碼子，如箭頭 ( b ) 所示?；疑幱氨硎就僖核岬鞍椎?12 個跨膜區(qū)域
對 1000 基因組計劃/Ensembl 數(shù)據(jù)庫中結(jié)構(gòu)變異的查詢沒有發(fā)現(xiàn)在健康個體中存在這種基因檢測突變。

溶酶體游離唾液酸貯積癥具有廣泛的臨床表現(xiàn)。Salla病代表最溫和的表型，在芬蘭和瑞典和丹麥等其他北歐國家最常發(fā)生。嬰兒型唾液酸貯積病表現(xiàn)出更嚴重的臨床表型，并且沒有地域差異。還存在嚴重程度介于 Salla 和嬰兒唾液酸貯積病ISSD 之間的 SASD 形式. Salla 患者通常在出生后第一年出現(xiàn)肌張力減退、共濟失調(diào)和眼球震顫，而NANA貯積病基因檢測患者在 3 歲時表現(xiàn)出精神運動發(fā)育延遲和遠視。隨著 Salla 疾病的進展，共濟失調(diào)通常仍然是一個突出的特征，但在本病例中并未發(fā)生共濟失調(diào)。相反，NANA貯積病基因檢測患者在的患者表現(xiàn)出肌張力增加，很可能是由于痙攣和強直的混合。與 Salla 病重疊的唯一臨床癥狀實際上是早期精神運動遲緩和言語問題，這本身并不是疾病特有的。MRI 結(jié)果進一步支持較輕的臨床表型，具有髓鞘發(fā)育不良和胼胝體變薄的弱特征，而 Salla 患者的典型表現(xiàn)是大腦和小腦萎縮、髓鞘發(fā)育不良和胼胝體發(fā)育不全。因此，本文描述NANA貯積病基因檢測患者在的患者表現(xiàn)出比 Salla 病更輕微的唾液酸貯積病SASD臨床表型，這使得正確診斷變得困難。NANA貯積病基因檢測患者的研究結(jié)果表明，對于腦病和輕度髓鞘形成不足和胼胝體變薄的患者，需要考慮對游離唾液酸進行分析。
游離尿唾液酸升高被認為是唾液酸貯積病SASD的生化標志，早在 3 日齡時就已觀察到. 因此，這些患者的總尿唾液酸（游離和結(jié)合）水平升高，并且該部分的比色測量通常用作唾液酸貯積病SASD和其他儲存唾液酸化寡糖的溶酶體疾病的第一個篩選生物標志物。根據(jù)NANA貯積病基因檢測的經(jīng)驗，絕大多數(shù)唾液酸貯積病SASD患者尿液中總唾液酸增加。然而，這里描述的患者在兩個單獨的采樣檢測顯示總唾液酸濃度處于臨界點。作為對定量測定的補充，尿樣中的寡糖篩查通常通過薄層色譜法進行，在這種情況下，這表明游離唾液酸水平升高。這通過尿液和成纖維細胞中游離唾液酸的定量測量得到證實。這些結(jié)果進一步突出了使用尿寡糖定性分析結(jié)合總唾液酸定量分析的重要性?？朔@些問題的另一種可能性是使用質(zhì)譜法并同時測量總唾液酸和游離唾液酸，這是佳學對這一疾病的臨床所建議的新標準，不久的將來將成為黃金標準。還應(yīng)提及的是，已在兩個沒有唾液尿癥的兄弟姐妹中報告了唾液酸貯積病SASD，他們都是 SLC17A5 中 Lys136Glu 突變的純合子。通過 H-NMR 光譜法檢測到腦脊液中存在增加的游離唾液酸，這一發(fā)現(xiàn)與髓鞘形成不足提示唾液酸貯積病SASD。
鑒于NANA貯積病基因檢測患者患者的異常表型，對SLC17A5的進一步研究是由尿液和成纖維細胞中游離唾液酸的升高驅(qū)動的。在新穎尋找致病變異的基因檢測中，對SLC17A5的編碼區(qū)進行了 Sanger 測序，除了無法擴增的外顯子 9 外，所有外顯子的結(jié)果均為陰性。因此，通過將家族納入神經(jīng)科致病基因鑒定基因檢測基因發(fā)現(xiàn)研究，使用非靶向診斷方法找出唾液酸貯積病SASD生物標志物升高的原因。WES 分析確定了 20 個受罕見變異影響的候選基因，這些變異預計會影響蛋白質(zhì)功能，但這些變異中沒有一個被認為可以很好地解釋患者觀察到的表型。有趣的是，仔細觀察SLC17A5基因，WES 基因檢測分析顯示內(nèi)含子 9 中存在未知大小或來源的純合插入。RT-PCR 和 Sanger 重測序基因檢測進一步證實存在 6040 bp 插入（RefSeq KF425758.1），它位于SLC17A5的內(nèi)含子 9 （外顯子 9 下游 24 bp），并顯示該插入是 LINE-1 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。內(nèi)含子 9 中大片段插入的存在可能解釋了通過初始 Sanger 測序無法擴增外顯子 9 的問題。這種大的轉(zhuǎn)座子插入先前已在SLC25A13中描述，導致 citrin 缺乏. 此外，導致基因組缺失的 L1 元件的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座插入已被證明會導致丙酮酸脫氫酶復合物缺乏。
通過捕獲蛋白質(zhì)編碼序列進行基因檢測，全外顯子組測序基因檢測僅分析人類基因組的一小部分（~1%），這種方法的缺點之一是“致病”變異可能位于捕獲區(qū)域之外，例如遺漏外顯子區(qū)域、深層內(nèi)含子變異、調(diào)控元件或基因組的其他非編碼區(qū)域。此外，WES 基因檢測不是檢測較大變異的最佳選擇，例如拷貝數(shù)變異和結(jié)構(gòu)變異。使用全基因組測序 (WGS) 基因檢測代替 WES基因檢測 可以克服這些問題，因為 WGS 基因檢測指的是對整個人類基因組的分析。在佳學基因的患者中，轉(zhuǎn)座子插入相對靠近外顯子-內(nèi)含子邊界（在 24 bp 以內(nèi)），神經(jīng)科系統(tǒng)致病基因鑒定基因解碼能夠使用 WES 基因檢測檢測到它，強調(diào)了對 NGS 數(shù)據(jù)進行全面分析和解釋以及進一步基因解碼分析的重要性分析以驗證使用 NGS 數(shù)據(jù)在疑似遺傳疾病和持續(xù)存在的獨特生化表型患者中發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)。
通過計算機分析研究了患者中這種純合子插入的可能后果。這些分析預測，除了外顯子 9 和內(nèi)含子 9 之間的正常剪接位點之外，該序列 24 bp 插入內(nèi)含子 9 會產(chǎn)生兩個剪接位點，出現(xiàn)在插入序列的 82 bp 和 679 bp 處。cDNA 基因檢測分析證實存在患者中的三個SLC17A5轉(zhuǎn)錄本為該區(qū)域所有三個剪接位點的存在提供支持。在計算機中由交替剪接位點產(chǎn)生的兩個轉(zhuǎn)錄本的翻譯預示著提前終止密碼子 4 bp 進入內(nèi)含子 9 并在氨基酸 421 處被截短。唾液酸蛋白由 12 個跨膜區(qū)域組成，在神經(jīng)系統(tǒng)致病基因鑒定基因解碼的患者中發(fā)現(xiàn)的基因突變應(yīng)該導致兩個缺失蛋白質(zhì)羧基末端的跨膜結(jié)構(gòu)域。
先前在SLC17A5 發(fā)現(xiàn)的 32 個突變顯示出廣泛的范圍（錯義和無義突變、剪接位點突變、插入和缺失），但是SLC17A5基因檢測并沒有提出直接的突變熱點。在唾液酸貯積病SASD中觀察到的表型變異似乎在某種程度上與 Arg39Cys 突變的存在相關(guān)，與復合雜合子患者中發(fā)現(xiàn)的其他突變相比，該變異似乎導致唾液酸蛋白功能得到更好的保留。因此，其他SLC17A5對唾液酸蛋白功能具有更多破壞性影響的基因突變被認為會導致 嬰兒唾液酸貯積病ISSD。然而，其他基因檢測結(jié)果對這一假設(shè)提出了質(zhì)疑。例如，已發(fā)現(xiàn) Lys136Glu 基因檢測突變的純合性會導致嚴重的 Salla 病和輕度唾液酸貯積病SASD表型?；蚪獯a分析報告了具有相同純合錯義突變的單一近交系受影響患者的唾液酸貯積病SASD表型變異性。這些發(fā)現(xiàn)表明SLC17A5中的多態(tài)性或其他參與游離唾液酸代謝的基因可能是同一基因檢測突變而產(chǎn)生不同的臨床癥狀的原因?！渡窠?jīng)系統(tǒng)疾病及其基因序列變化》已記錄到導致外顯子 10 和 11 缺失的突變會產(chǎn)生嚴重后果，這與NANA貯積病基因檢測案例 中的患者較溫和的表型形成對比。此處討論的案例對所觀察到的較溫和的表型提出了有趣的解釋，盡管可以假定外顯子 10 和 11 無法翻譯。因此，神經(jīng)系統(tǒng)致病基因鑒定基因解碼提出以下解釋：在NANA貯積病基因檢測的案例的患者中，除了導致異常轉(zhuǎn)錄的兩個新剪接位點之外，基因檢測確實確定了正常轉(zhuǎn)錄本，這是保留正常剪接位點的結(jié)果。低水平野生型蛋白的存在可能提供一些運輸唾液酸的能力，盡管不足以保持患者健康。
 

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