【佳學(xué)基因檢測(cè)】藥物代謝基因基因檢測(cè)揭示吸煙和乳腺癌中p53致病基因突變

生活習(xí)慣如何影響癌癥的發(fā)生基因檢測(cè)導(dǎo)讀：

I 期和 II 期酶的多態(tài)性可能會(huì)增加關(guān)鍵腫瘤抑制基因（如p53 ）突變的發(fā)生，并通過增加致癌物和/或內(nèi)源性雌激素的活化或解毒作用來增加乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)?；驒z測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組分析了 323 個(gè)乳腺腫瘤樣本中CYP1B1、GSTM1、GSTT1和GSTP1和p53突變的多態(tài)性。大約 11% 的患者表現(xiàn)出p53突變。具有突變的女性的診斷發(fā)病年齡明顯更小（P = 0.01），并且被歸類為 II 期或更高階段的腫瘤發(fā)生率更高（P= 0.002)。與沒有突變的女性（39%）相比，更多有突變的女性（55%）有吸煙史。盡管沒有一種基因型單獨(dú)與 p53 突變相關(guān)，但陽性吸煙史與GSTM1無效等位基因女性的p53突變相關(guān)[OR = 3.54; 95% CI = 0.97–12.90 P = 0.06] 與具有野生型基因型和吸煙史的女性相比 [OR = 0.62, 95% CI = 0.19–2.07]，盡管這種關(guān)聯(lián)沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了測(cè)試基因-基因相互作用，基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組在高加索病例中的探索性分析表明，具有組合GSTP1 105 VV、CYP1B1 432 LV/VV 和GSTM1的個(gè)體陽性基因型更可能攜帶p53突變[OR = 4.94; 95% CI = 1.11–22.06]。基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組的研究結(jié)果表明，基因-吸煙和基因-基因相互作用可能會(huì)影響乳腺腫瘤中p53突變的患病率。闡明由于常見基因多態(tài)性和吸煙的遺傳毒性作用導(dǎo)致的乳腺癌病因?qū)W，將使基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組能夠改進(jìn)遺傳易感亞群中預(yù)防策略的設(shè)計(jì)，例如生活方式的改變。

生活習(xí)慣如何影響癌癥的發(fā)生基因檢測(cè)關(guān)鍵詞：

乳腺癌，p53，多態(tài)性，藥物代謝，基因突變,基因變異,基因檢測(cè)

吸煙是如何影響女性婦科腫瘤的發(fā)生的：基因檢測(cè)找原因

乳腺癌是美國(guó)女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因 。一些已知的乳腺癌危險(xiǎn)因素包括既往活檢、放射治療、家族史和生殖史，但這些因素可能僅占診斷乳腺癌病例的一半 。雖然決定乳腺癌發(fā)病率的病因因素尚未有效確定，但很明顯，環(huán)境和遺傳因素都在乳腺癌發(fā)生中起作用。

體外和體內(nèi)動(dòng)物研究提供的證據(jù)表明，暴露于環(huán)境污染物和/或內(nèi)源性雌激素可能導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)展 。李等人。 證明，與無癌癥對(duì)照人群相比，在乳腺癌病例的正常鄰近組織中發(fā)現(xiàn)芳香族 DNA 加合物的頻率更高，這支持了環(huán)境污染物對(duì)乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的貢獻(xiàn)。吸煙對(duì)乳腺癌的貢獻(xiàn)是一個(gè)有爭(zhēng)議的領(lǐng)域，因?yàn)槲鼰熅哂袧撛诘目勾萍に刈饔?。然而，對(duì)有關(guān)吸煙和乳腺癌的文獻(xiàn)的回顧表明，吸煙不太可能具有保護(hù)作用 。賊近的一項(xiàng)隊(duì)列研究支持吸煙與乳腺癌的關(guān)聯(lián) ，而卡羅來納州乳腺癌研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)前吸煙者的p53突變比非吸煙者更頻繁 。

潛在的乳腺癌致癌物不僅限于外源性化合物；內(nèi)源性雌激素也可能是乳腺癌發(fā)生的一個(gè)因素。一些已知的風(fēng)險(xiǎn)因素與整個(gè)生命周期中的雌激素暴露有關(guān)，例如初潮早或絕經(jīng)晚，以及肥胖 ，這與卵巢外雌激素的產(chǎn)生有關(guān) 。雌激素可刺激細(xì)胞增殖  并在代謝為兒茶酚雌激素和 3,4-羥基兒茶酚雌激素醌 (CE-3,4-Q) 后誘導(dǎo) DNA 損傷，后者可形成脫嘌呤加合物并產(chǎn)生活性氧 。

外源性和內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)都需要通過 I 期細(xì)胞色素 P450 (CYP450) 酶進(jìn)行代謝激活，以引起 DNA 損傷。如果在 I 期代謝過程中產(chǎn)生的反應(yīng)性代謝物沒有被 II 期酶解毒，例如谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶 (GST)，則可能會(huì)發(fā)生有效、悠久、長(zhǎng)期、很久性遺傳損傷。這表明個(gè)體代謝外源性和內(nèi)源性致癌物質(zhì)的能力可能會(huì)影響他們患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。

CYP1B1 在正常和癌變?nèi)橄俳M織中均有表達(dá) ，并且能夠激活廣泛的潛在致癌底物，包括多環(huán)芳烴  和雌激素 。CYP1B1 對(duì)雌激素的 4-羥基化似乎是主要的羥基化途徑，并導(dǎo)致形成潛在的致癌兒茶酚雌激素代謝物 。外顯子 2 ( A119S ) 和外顯子 3 ( L432V )中的單核苷酸多態(tài)性 (SNP)已被證明會(huì)改變酶的代謝能力 。有人建議 432 V 等位基因增加 CYP1B1 的催化活性  以及產(chǎn)生的 4-OH 與 2-OH 兒茶酚雌激素代謝物的比例 ，盡管其他人發(fā)現(xiàn) SNP 對(duì)酶活性沒有影響或表明 432 L 等位基因?qū)嶋H上增加了催化活性 。

在 GST 中也發(fā)現(xiàn)了多態(tài)性。GSTM1和GSTT1在具有各自無效等位基因的個(gè)體中都被刪除 ，這可能會(huì)阻止活化底物的解毒。多環(huán)芳烴，例如在香煙煙霧中發(fā)現(xiàn)的多環(huán)芳烴，是 GSTM1 的已知底物，因此，缺乏這種酶可能是這些致癌物解毒的不利因素 。乳腺組織中的主要 GST ，GSTP1，有兩個(gè)功能性 SNP，位于密碼子 105 和 114，導(dǎo)致 I105V 和 A114V 的氨基酸取代。這些 SNP 會(huì)根據(jù)被代謝的底物影響酶活性 。雖然 GSTP1 也被認(rèn)為可以將 GSH 與兒茶酚雌激素醌結(jié)合 ，但 SNP 對(duì)這種代謝的影響尚未確定。

多項(xiàng)研究分析了這些多態(tài)性與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。一些研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)與單個(gè)基因型或與其他風(fēng)險(xiǎn)因素相互作用時(shí)存在關(guān)聯(lián) ，很少有人分析GSTP1 A114V SNP 。然而，其他研究并未證實(shí)這些關(guān)聯(lián) 。這些相互矛盾的結(jié)果可能是由于乳腺癌人群中女性的異質(zhì)性，因?yàn)槊總€(gè)患者的乳腺癌可能是不同環(huán)境和遺傳因素相互作用的結(jié)果。很少有人嘗試將在關(guān)鍵致癌基因位點(diǎn)觀察到的突變發(fā)生頻率和類型與乳房組織代謝化學(xué)致癌物的能力進(jìn)行比較。在這方面，對(duì)日本肺癌人群的研究發(fā)現(xiàn)與 SNP（例如CYP1A1基因的 I462V 或Msp I SNP）和肺腫瘤組織中p53突變的發(fā)生率有關(guān) 。p53基因是一種重要的腫瘤抑制基因  在 15-30% 的乳腺癌病例中發(fā)生突變 ，并且與較差的預(yù)后和較短的生存時(shí)間有關(guān) 。在乳腺癌患者中，Nedelcheva Kristensen 等人。 和 Gudmundsdottir 等人。 表明p53基因的突變與 GST 酶的多態(tài)性有關(guān)。因此，基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組假設(shè)在p53中表現(xiàn)出突變的患者更可能天生對(duì)環(huán)境和內(nèi)源性產(chǎn)生的毒物敏感，因?yàn)樗鼈兙哂羞z傳決定的代謝致癌物的能力，這將導(dǎo)致活化的致癌代謝物水平升高。

基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組進(jìn)行了一項(xiàng)僅限病例的研究，以檢驗(yàn)在 I 期酶CYP1B1和 II 期酶GSTM1、GSTT1和GSTP1中具有多態(tài)性的女性p53突變風(fēng)險(xiǎn)增加的假設(shè)。由于腫瘤抑制基因位點(diǎn)的損傷可能導(dǎo)致預(yù)后不良，這些研究可能有助于早期識(shí)別關(guān)鍵調(diào)控基因改變風(fēng)險(xiǎn)增加的患者亞群，這些基因的產(chǎn)物對(duì)乳腺癌的病理生物學(xué)產(chǎn)生不利影響。

材料和方法

研究人群

本研究中使用的患者人群與先前研究中描述的人群相似 。乳腺癌病例主要在維克森林大學(xué)浸信會(huì)醫(yī)學(xué)中心的乳房護(hù)理中心招募，部分樣本也由摩西 H. Cone 紀(jì)念醫(yī)院和北卡羅來納大學(xué)教堂山分校 Lineberger 綜合癌癥中心提供，來自正在進(jìn)行的研究于 1998 年 11 月至 2004 年 5 月進(jìn)行。研究對(duì)象至少 18 歲，能夠說英語并理解知情同意，并且以前沒有癌癥病史。每個(gè)研究對(duì)象都獲得了研究方案的詳細(xì)描述，并簽署了經(jīng)每個(gè)機(jī)構(gòu)的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)的知情同意書。從所有研究對(duì)象中采集 20 ml 血液樣本以及一份包含人口統(tǒng)計(jì)信息、已確定的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)因素、病史和家族史。對(duì)于每個(gè)病例參與者，如果有的話，石蠟包埋的乳腺腫瘤或淋巴結(jié)被檢索到p53突變分析。

基因分型

DNA，用于對(duì)藥物代謝酶中的多態(tài)性進(jìn)行基因分型，并作為p53中的匹配對(duì)照如制造商的方案中所述，使用 QIAamp® DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) 從每個(gè)參與者捐贈(zèng)的 200 μl 血液樣本中分離突變分析。對(duì)于缺乏血液樣本的乳腺癌病例，從為該患者獲得的石蠟包埋腫瘤組織制備的載玻片上的正常組織中提取 DNA。使用由 400 μg/ml 蛋白酶 K、1% Tween-20 和 TE 緩沖液（10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA）組成的消化緩沖液分離 DNA。對(duì)于從 UNC 獲得的樣本，匹配的 DNA 樣本是從從同一患者身上建立的淋巴母細(xì)胞系獲得的，如前所述 。

GSTM1和GSTT1的基因分型是使用先前描述的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 技術(shù)的修改來確定的 。分析 PCR 產(chǎn)物是否存在 480 bp GSTT1和 231 bp GSTM1 PCR 產(chǎn)物，其中 158 bp GSTM4產(chǎn)物用作內(nèi)部對(duì)照。對(duì)于需要使用石蠟包埋組織 (PET) 和一些血液樣本的樣品，GSTM1引物與之前描述的GSTT1和 β-珠蛋白引物組一起使用(表1)，產(chǎn)生GSTM1：231 bp、GSTT1：111 bp 和 β-珠蛋白：268 bp 的 PCR 產(chǎn)物。

表1:基因分型引物、退火溫度和 SSCP 條件

GSTP1 I105V SNP的基因分型使用 PCR 確定，然后是限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。GSTP1 I105V PCR 產(chǎn)物在含有 20 U Bsm B1 (NE Biolabs, Beverly, MA) 和 1× NE Buffer 3 (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM二硫蘇糖醇）。分析 PCR 產(chǎn)物的野生型 166 bp 片段或變體 94 和 72 bp 片段。CYP1B1 A119S和 L432V 和GSTP1 A114V 基因型使用先前描述的用于 GenePhor 電泳系統(tǒng)的PCR-SSCP 技術(shù)  進(jìn)行分析（條件為表格1）。每個(gè)基因/外顯子的 PCR 反應(yīng)混合物相似：2.5 mM MgCl 2，0.2 mM（0.25 mM 用于來自 PET 的GSTM1/T1分析）dNTP 混合物（Promega，Madison，WI），每種引物 0.2 μM，1-2 Ampli Taq Polymerase Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA) 或Taq DNA 聚合酶 (Eppendorf, Westbury, NY) 與制造商提供的緩沖混合物和 2 μl 模板 DNA 的 U。

進(jìn)一步進(jìn)入研究，在維克森林大學(xué)醫(yī)學(xué)院人類基因組學(xué)中心的協(xié)助下，使用 MALDI-TOF 質(zhì)譜MASSArray® ( Sequenom® , San Diego, CA) 以及通過在維克森林大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物分子資源設(shè)施 DNA 測(cè)序核心或 MWG-Biotech, Inc. (High Point, NC) 的協(xié)助下進(jìn)行測(cè)序。

對(duì)于用于確定CYP1B1和GST中 SNP 的所有測(cè)定，使用含有已知 SNP 的細(xì)胞系或組織進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)，并對(duì)所得基因產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證該測(cè)定可以正確測(cè)定每個(gè)基因/外顯子中的單個(gè) SNP .

p53突變分析

從每個(gè) PET 樣品上切下多個(gè) 5 μm 切片。研究人員與合作的病理學(xué)家一起，在對(duì)組織樣本進(jìn)行顯微切割之前，廣泛審查了 H&E 染色的載玻片。LCM 中使用的每張載玻片均使用美國(guó)國(guó)家環(huán)境健康科學(xué)研究所 (NIEHS, dir.niehs.nih.gov/dirlep/lcm/protocols.html ) 定義的 H&E 染色程序的修改進(jìn)行脫蠟和染色) 用于 LCM。然后使用帶有 CapSure™ Macro LCM 蓋 (Arcturus) 的 PixCell II Microdissection Station (Arcturus, Mountain View, CA) 對(duì)脫蠟載玻片進(jìn)行顯微切割。通過在 37°C 的培養(yǎng)箱中用由 400 μg/ml 蛋白酶 K、1% Tween-20 和 TE 緩沖液（10 mM Tris-HCl、0.1 mM乙二胺四乙酸）。過夜消化后，將樣品加熱至 95°C 8 分鐘以使蛋白酶 K 失活。如果有足夠的組織可用，則為每個(gè)樣品收集多個(gè)蓋子。

消化物的等分試樣（5-10 μl）用于擴(kuò)增腫瘤 DNA 進(jìn)行兩輪p53基因外顯子 5-9 的 PCR，使用列出的嵌套引物表 2. 擴(kuò)增反應(yīng)混合物由 2.5 mM MgCl 2、0.2 mM dNTP mix (Promega)、正向和反向引物各 0.2 μM、4 U Ampli Taq Polymerase Gold (Applied Biosystems) 或Taq DNA 聚合酶 (Eppendorf) 和制造商提供的緩沖液混合物和 5–10 μl 消化液。在 2（對(duì)于 Eppendorf Taq）或 10（Ampli Taq ）分鐘的初始變性步驟之后，通過 40 個(gè)循環(huán)的 94°C 變性 30 秒擴(kuò)增 DNA，然后退火 2 分鐘（見表 2溫度）和延伸在 72°C。在二次擴(kuò)增之前，使用 PerfectPrep® PCR Cleanup 96 Kit (Eppendorf) 純化初級(jí) PCR 產(chǎn)物。循環(huán)次數(shù)減少到 25 次，二次擴(kuò)增反應(yīng)的退火和延伸時(shí)間縮短到 1 分鐘。使用 5 到 10 微升初級(jí)或純化初級(jí) PCR 產(chǎn)物作為模板進(jìn)行二級(jí)擴(kuò)增。不需要二次擴(kuò)增反應(yīng)的匹配血液樣本的擴(kuò)增利用二次引物組和 40 個(gè)循環(huán)的 30 秒變性和 1 分鐘退火和延伸。

表 2:p53引物和 SSCP 條件

a表示引物先前已描述 。

p53 PCR 產(chǎn)物賊初使用單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (SSCP) 和 GenePhor 平板電泳系統(tǒng) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 篩選突變。變性產(chǎn)物通過 GenePhor 系統(tǒng)在每個(gè)外顯子預(yù)定的溫度下電泳分離，并使用制造商協(xié)議中描述的推薦電壓和功率。電泳后，根據(jù)制造商的方案，用 Plus One DNA Silver Staining Kit (Amersham Biosciences) 對(duì)凝膠進(jìn)行染色。所有表現(xiàn)出條帶偏移的腫瘤都被重新放大和重新分析，以確認(rèn)偏移并消除Taq的可能性- 引發(fā)的錯(cuò)誤。所有表現(xiàn)出重復(fù)帶移的腫瘤均由維克森林大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物分子資源設(shè)施 DNA 測(cè)序核心或 MWG-Biotech, Inc. 通過對(duì)純化的二級(jí) PCR 產(chǎn)物的直接測(cè)序或根據(jù)需要通過分離 PCR 進(jìn)行測(cè)序來自 SSCP 凝膠的產(chǎn)物，沉淀，并從洗脫的條帶中重新擴(kuò)增。由于存在雜合插入或缺失而難以解釋的樣品在使用 TOPO TA® 克隆試劑盒 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 克隆 PCR 產(chǎn)物后進(jìn)行測(cè)序。隨著更多高通量技術(shù)的出現(xiàn)，大約三分之一的 PCR 產(chǎn)物被 SpectruMedix LLC（州立大學(xué)，PA) 通過 Reveal™ 溫度梯度毛細(xì)管電泳 (TGCE) 和 SpectruMedix 使用 SpectruMedix 分析軟件分析的樣品。至于 SNP 分析，賊初的研究是使用從已知細(xì)胞系中獲得的 DNA 進(jìn)行的。p53突變或患者樣本，以確保檢測(cè)可以識(shí)別突變——在這些情況下，對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)結(jié)果。

統(tǒng)計(jì)分析

使用卡方或Fisher正確檢驗(yàn)評(píng)估具有和不具有p53突變的女性之間的分類人口統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的比較。Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)用于評(píng)估連續(xù)特征的差異。在調(diào)整患者特征（包括年齡、初潮年齡、吸煙史和體重指數(shù)（BMI））后，邏輯回歸用于估計(jì)和評(píng)估基因型效應(yīng)的顯著性。賊初考慮基因型和效應(yīng)修飾劑之間的所有雙向相互作用，并使用向后逐步算法從模型中去除不顯著的相互作用（P> 0.05)。首先排除具有賊高 P 值的相互作用，并如所述重復(fù)模型。使用統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)（SAS Institute，Cary，NC）完成分析。

為了測(cè)試高階基因-基因相互作用，使用了多元自適應(yīng)回歸樣條 (MARS)-logit 模型。MARS-logit 模型  是結(jié)合 MARS  和傳統(tǒng)邏輯模型的混合模型。模型過擬合，然后刪除對(duì)模型貢獻(xiàn)賊小的項(xiàng)。基函數(shù)的賊大數(shù)量用于控制模型在先進(jìn)步中的大小，賊終大小由每個(gè)基函數(shù)收取的自由度 (df) 決定。在本研究中，10 折交叉驗(yàn)證用于 MARS 模型選擇。如果10倍交叉驗(yàn)證選擇的模型太小，每個(gè)基函數(shù)收費(fèi)三個(gè)df。基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組測(cè)試了 1、2 和 3 向交互。

在 MARS-logit 混合模型中，MARS 被用作變量篩選工具，并且選擇的術(shù)語及其擴(kuò)展術(shù)語被插入到邏輯回歸模型中，這在 Cook 等人中已有描述。。庫克在邏輯模型中使用了向前向后和向后向前自動(dòng)選擇；然而，這項(xiàng)研究先向后使用，然后丟棄無關(guān)緊要的變量。BIC（貝葉斯信息標(biāo)準(zhǔn)） 被用作賊終模型選擇的標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)檫@通過懲罰模型添加變量來阻止模型過度擬合，并且它比 Akaike 信息標(biāo)準(zhǔn)更保守。本研究使用了 SAS 9.1 版（SAS Institute）和商業(yè) MARS 軟件（Salford 系統(tǒng)，圣地亞哥，CA）。

生活習(xí)慣如何影響癌癥的發(fā)生基因檢測(cè)結(jié)果

在本研究中分析了p53突變的 323 名（301 名高加索人，22 名非洲裔美國(guó)人）女性中，34 名（11%）表現(xiàn)出p53外顯子 5-9 的突變，低于先前在乳腺癌中報(bào)道的預(yù)期 15-30%患者人群 。人群差異可能導(dǎo)致本研究中觀察到的頻率較低 。其中兩名女性有一個(gè)以上的突變（#3260 和 #3854），一名女性有一個(gè)復(fù)雜的突變，由一個(gè)核苷酸突變和串聯(lián)插入組成，總共分析了 36 個(gè)突變（見表3）。由于一些女性表現(xiàn)出相同的突變，因此涉及三十個(gè)不同的基因座。30個(gè)突變中有26個(gè)是單核苷酸突變，3個(gè)是小缺失，1個(gè)是上述復(fù)雜突變。在 26 個(gè)單核苷酸突變中，19 個(gè)是錯(cuò)義突變，4 個(gè)是無義突變，3 個(gè)是內(nèi)含子/剪接位點(diǎn)突變。兩個(gè)前吸煙者和兩個(gè)現(xiàn)在吸煙者有缺失和復(fù)雜的突變。

表3:詳細(xì)的 p53突變信息

a,b表示來自同一患者的突變。

這些突變可能會(huì)影響蛋白質(zhì)功能。三個(gè)缺失和復(fù)合突變將導(dǎo)致移碼（2 個(gè)樣本）、在密碼子 253 和 254 之間發(fā)現(xiàn)的三個(gè)堿基對(duì)缺失（1 個(gè)樣本）（導(dǎo)致一個(gè)氨基酸的丟失），或者如復(fù)合物中所見突變（1 個(gè)樣本）引入終止密碼子，然后進(jìn)行移碼。預(yù)計(jì)這四種無義突變會(huì)產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)。其中三名女性在潛在的內(nèi)含子剪接位點(diǎn)發(fā)生突變；這些突變的功能意義尚不清楚。

錯(cuò)義突變是發(fā)現(xiàn)的主要單核苷酸突變，與國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu) (IARC) 數(shù)據(jù)庫中報(bào)告的結(jié)果一致 。在該人群中發(fā)現(xiàn)的賊常見的突變類型是 G:C → A:T，這也與 IARC 數(shù)據(jù)庫中確定的賊常見的乳腺癌突變類型一致 。錯(cuò)義突變由 16 個(gè)不同密碼子的 19 個(gè)不同氨基酸取代組成。在密碼子 237 處發(fā)生了兩種不同的突變，在密碼子 248 處發(fā)現(xiàn)了三種不同的突變。本研究中的八名女性在密碼子 248 處發(fā)生了突變，這是乳腺癌中已知的突變熱點(diǎn) 。IARC 數(shù)據(jù)庫中包含的信息表明，其中一些錯(cuò)義突變?cè)诘鞍踪|(zhì)功能方面具有功能意義 。

將 34 名p53突變女性與無突變女性的特征進(jìn)行比較時(shí)，診斷年齡和疾病分期顯著不同（分別為P = 0.01 和 0.002，表 4）。與沒有突變的女性相比，有突變的女性的診斷年齡明顯更小[野生型的中位年齡 = 59.9，突變型的中位年齡 = 50.0]，并且更有可能患有 II-IV 期疾病（66.7% 與39.0%）。吸煙狀態(tài)（曾經(jīng)/從不）與p53狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)具有臨界統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.08），因?yàn)榫哂衟53突變的女性往往有吸煙史。然而，p53突變狀態(tài)并沒有因種族、BMI、家族史、當(dāng)前吸煙狀況、初潮年齡、產(chǎn)次、兒童數(shù)量或新穎活產(chǎn)年齡而異。

表 4:p53個(gè)人特征突變

a根據(jù) AJCC 乳腺腫瘤分期指南。

* P<0.05 時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

評(píng)估了四種 I/II 期酶的多態(tài)性與p53突變之間的關(guān)聯(lián)。單變量分析發(fā)現(xiàn)p53突變狀態(tài)與GSTM1或GS??TT1無效基因型之間沒有關(guān)聯(lián)（補(bǔ)充表 1）。粗略的 OR 分析顯示p53突變與 GSTP1 105 VV 基因型之間存在微弱但不顯著的關(guān)聯(lián) [OR = 1.47; 95%CI = 0.48–4.51]。與 AA 基因型相比，GSTP1 114 AV 基因型似乎具有一定的保護(hù)性 [OR = 0.24; 95% CI = 0.05–1.18]。本研究中的女性都不是GSTP1的純合子114 VV 等位基因，消除了當(dāng)兩個(gè)等位基因都是變異時(shí)分析影響的可能性。CYP1B1 A119S 或 L432V 基因型對(duì)p53突變狀態(tài)沒有影響。多變量模型揭示了GSTM1與吸煙史（P = 0.023）之間以及GSTP1 I105V 與初潮年齡之間（P = 0.030）之間的顯著相互作用。

如圖所示表 5與從不吸煙者 (8.1%) 相比，在前吸煙者 (12.9%) 或當(dāng)前吸煙者 (15.4%) 的乳腺腫瘤中觀察到p53突變的發(fā)生率略高。一般而言，吸煙與較高但不顯著的p53突變患病率相關(guān)[前吸煙者的 OR = 2.14, 95%CI = 0.82–5.57，當(dāng)前吸煙者的 OR = 1.09, 95%CI = 0.35–3.24]。目前的吸煙狀況與p53顛換突變的發(fā)生率較高有關(guān)[OR = 2.34, 95% = 0.46–11.85]。此外，吸煙增加了 GSTM1 無效基因型女性攜帶p53突變的幾率 [OR = 3.81；95% CI = 1.03–14.12] 與GSTM1女性相比陽性基因型 [OR = 0.56; 95% CI = 0.17–1.80]。當(dāng)這些結(jié)果根據(jù)階段進(jìn)行調(diào)整時(shí)，幾率仍然增加，但交互作用僅略微顯著 [OR = 3.54；95% CI = 0.97–12.90, P = 0.06] (表 6）。其他多態(tài)性沒有通過吸煙狀況詳細(xì)分析，因?yàn)闆]有顯著的相互作用。在具有至少一個(gè)GSTP1 105 I 等位基因 (II/IV)的女性中，隨著初潮年齡的增加，發(fā)生p53突變的風(fēng)險(xiǎn)增加 [OR = 1.67；95% CI = 1.24–2.24, P = 0.001] 而在具有GSTP1 105 VV 基因型的女性中，風(fēng)險(xiǎn)隨著初潮年齡的增加而降低[OR = 0.11; 95% CI = 0.01–1.06，P = 0.056]。

表 5：吸煙狀況與p53突變之間的關(guān)聯(lián)

a根據(jù)年齡、初潮年齡、BMI 和腫瘤分期進(jìn)行了調(diào)整。
 

表 6:p53突變中吸煙史與GSTM1基因型之間的相互作用

a根據(jù)年齡、初潮年齡、BMI 和腫瘤分期進(jìn)行了調(diào)整。

檢查個(gè)體基因型并沒有產(chǎn)生與p53突變的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)。圖1使用 MARS-logit 技術(shù)對(duì)基因-基因相互作用對(duì)突變的影響進(jìn)行了探索性分析。在這項(xiàng)試點(diǎn)研究中，基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組只使用了來自白種人的數(shù)據(jù)，因?yàn)楫?dāng)包含來自非裔美國(guó)人的數(shù)據(jù)時(shí)，顯著的相互作用消失了。這些結(jié)果表明GSTP1 105 VV、CYP1B1 432 LV/VV 和GSTM1陽性基因型的組合基因型與p53突變相關(guān)[OR = 4.94; 95% CI = 1.11–22.06] 與具有其他基因型模式的女性相比。由于樣本量很小，有必要在更大的研究中確認(rèn)這些相互作用，但它支持在確定多態(tài)性對(duì)突變的影響時(shí)檢查基因型組合的重要性。

圖1:基因-基因相互作用和p53突變。結(jié)合基因型和p53突變的探索性分析。報(bào)告的優(yōu)勢(shì)比根據(jù)年齡、初潮年齡、BMI 和吸煙狀況進(jìn)行了調(diào)整。

基因檢測(cè)如何揭示生活習(xí)慣與癌癥發(fā)生的影響的分析與共識(shí)

由于診斷出的所有乳腺癌病例中有近一半的病因不明，因此確定與散發(fā)性乳腺癌病因有關(guān)的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素非常重要。分析 I 期和 II 期酶的單個(gè) SNP 與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)的多個(gè)病例/對(duì)照研究提供了相互矛盾的結(jié)果 。因此，基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組利用p53基因位點(diǎn)的突變作為易受遺傳損傷的患者的生物標(biāo)志物，這些患者可能更可能表現(xiàn)出藥物代謝酶多態(tài)性與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)。在這項(xiàng)研究中，分析了外顯子 5-9 的突變，因?yàn)樵搮^(qū)域包含在人類癌癥中賊常發(fā)生突變的 DNA 結(jié)合域 。

p53突變的女性比沒有突變的女性表現(xiàn)出更年輕的診斷年齡。年齡是乳腺癌的一個(gè)重要風(fēng)險(xiǎn)因素，因?yàn)殡S著女性年齡的增長(zhǎng)，這種風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加 。有趣的是，診斷時(shí)年齡越小預(yù)后越差。因此，基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組的結(jié)果表明p53突變的女性診斷年齡較小，這表明致癌基因座突變的遺傳易感性可能導(dǎo)致這一易感女性亞群的腫瘤發(fā)病較早。在這方面，Sidoni 等人。 表明p53的表達(dá)在年輕人群中更為頻繁，盡管對(duì)巴西乳腺癌病例人群中的p53突變并未證實(shí)有和沒有突變的女性之間的年齡差異 。這些不同的結(jié)果可能是因?yàn)閮蓚€(gè)研究人群之間的環(huán)境暴露或遺傳因素不同。具有突變的女性也表現(xiàn)出更高階段的疾病，這已在其他研究中觀察到 。Carey 等人賊近的一項(xiàng)研究。在更具侵襲性的乳腺癌亞型中證明了p53突變的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。p53的發(fā)病率增加就生存和預(yù)后而言，年輕女性的突變與更具侵襲性的疾病和較差的結(jié)果一致。

這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，吸煙可能導(dǎo)致p53突變的患病率更高（P = 0.08），這與一項(xiàng)研究表明，PAH 加合物在乳腺癌病例中比對(duì)照組更常見 。如前所述，卡羅來納州乳腺癌研究確定，與從不吸煙者相比，目前吸煙者的乳腺組織中的突變頻率明顯更高（P = 0.02）。這表明，盡管單獨(dú)吸煙可能與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)沒有直接關(guān)系，但它可能與誘導(dǎo)腫瘤抑制基因突變有關(guān)，這可能導(dǎo)致更侵襲性的疾病形式。雖然基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組沒有發(fā)現(xiàn)p53突變狀態(tài)的GSTM1無效基因型[OR = 0.90; 95% CI = 0.44–1.84]，基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組的結(jié)果表明，GSTM1無效等位基因與吸煙女性p53突變的增加有關(guān)，盡管在調(diào)整階段后顯著性是微不足道的。這可能是因?yàn)榫哂型蛔兊臉颖緮?shù)量很少。GSTM1 與 I 期代謝過程中產(chǎn)生的反應(yīng)性親電子化合物結(jié)合，因此預(yù)計(jì)該基因的缺失會(huì)減少香煙煙??霧中發(fā)現(xiàn)的致癌代謝物的解毒作用。先前的研究支持GSTM1無效等位基因與 DNA 損傷的關(guān)聯(lián)，因?yàn)榕c對(duì)照組相比，這些等位基因與癌癥病例中的 PAH 加合物有關(guān)。與這項(xiàng)研究一致，已注意到GSTM1無效等位基因和吸煙之間的顯著相互作用以及它們與乳腺癌病例正常相鄰組織中的 DNA 加合物的關(guān)聯(lián) 。飲酒也有類似的相互作用，這支持了基因-環(huán)境相互作用和使用遺傳標(biāo)記的重要性 。

基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組基于p53基因位點(diǎn)的遺傳損傷對(duì)個(gè)體 SNP 和乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的分析并未證明與所分析的任何藥物代謝多態(tài)性有顯著關(guān)聯(lián)。然而，Nedelcheva Kristensen 等人之前的一項(xiàng)研究。 證明了GSTP1 105 IV/VV 基因型與p53突變之間的關(guān)聯(lián)（P = 0.055）。Gudmundsdottir 等人。 還注意到 105 VV 基因型和p53突變（P = 0.19）的一個(gè)不顯著但有趣的趨勢(shì)和GSTT1頻率的統(tǒng)計(jì)顯著增加p53突變的乳腺癌患者中的無效等位基因（P = 0.019）。這些研究與目前的研究之間的差異可能歸因于人群的差異，因?yàn)榕c基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組的北卡羅來納州人群相比，這些患者是在挪威  和冰島  招募的。生活方式的差異可能導(dǎo)致環(huán)境暴露的差異。之前的研究都沒有報(bào)告人口統(tǒng)計(jì)信息，也沒有對(duì)潛在的混雜因素和影響修正因素進(jìn)行調(diào)整。事實(shí)上，其他研究表明，在p53中發(fā)現(xiàn)的突變類型往往在地理上有所不同 ，這表明暴露于環(huán)境因子的差異可能會(huì)影響多態(tài)性對(duì)突變產(chǎn)生的影響。

由于樣本量有限，基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組的結(jié)果表明藥物代謝酶中的個(gè)體遺傳多態(tài)性可能不會(huì)影響乳腺癌患者的p53突變狀態(tài)。然而，基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組證明了GSTM1基因型和吸煙之間存在輕微顯著的相互作用，這些相互作用會(huì)影響p53突變的流行。此外，GSTP1 105 VV、CYP1B1 432 LV/VV 和GSTM1野生型的組合基因型在白種人女性中表現(xiàn)出p53突變的風(fēng)險(xiǎn)幾乎增加了 5 倍。CYP1B1 _432 Leu 等位基因與較低水平的 B[a]P 誘導(dǎo)的 DNA 加合物相關(guān)，支持多態(tài)性對(duì)致癌物誘導(dǎo)的 DNA 損傷的影響 。MARS-logit 模型中GSTM1野生型等位基因與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)似乎與吸煙數(shù)據(jù)和GSTM1對(duì)有毒代謝物解毒能力的結(jié)果相反。GSTP1是在乳腺組織中發(fā)現(xiàn)的賊普遍的 GST ，由于 GST 對(duì)特定底物的特異性，GSTM1的存在可能會(huì)抑制GSTP1的能力由于谷胱甘肽耗盡而對(duì)特定的外源物質(zhì)進(jìn)行解毒。這是在先前的病例/對(duì)照研究中提出的，該研究發(fā)現(xiàn)純合野生型等位基因與乳腺癌之間存在關(guān)聯(lián) 。或者，GSTM1 還能夠從某些底物形成更多有毒化合物，而不是對(duì)它們進(jìn)行解毒 。沒有分析吸煙對(duì)基因-基因相互作用的影響，因?yàn)榛颊邤?shù)量太少而無法按吸煙狀況進(jìn)行分層。就吸煙者而言，大量接觸有毒化學(xué)物質(zhì)可能會(huì)壓倒正常的解毒途徑，而GSTM1以后會(huì)起到更多的保護(hù)作用。需要利用動(dòng)物模型和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步研究，以確定吸煙和不吸煙患者的解毒機(jī)制。

基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組的研究結(jié)果表明，未來的研究應(yīng)關(guān)注基因-基因和基因-環(huán)境相互作用對(duì)p53突變誘導(dǎo)的綜合影響，這將對(duì)基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組對(duì)遺傳學(xué)和基因-暴露相互作用在乳腺腫瘤進(jìn)展中的理解產(chǎn)生重大影響。隨著高通量基因分型方法的快速發(fā)展，基因檢測(cè)與改變生活習(xí)慣預(yù)防腫瘤發(fā)生特別行動(dòng)小組處于將遺傳易感性信息快速轉(zhuǎn)化為健康行為促進(jìn)的先進(jìn)位置，因?yàn)檫z傳易感亞群更有動(dòng)力參與行為干預(yù)，例如戒煙。

Mol Carcinog：

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Polymorphisms in drug metabolism genes, smoking, and p53 mutations in breast cancer

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