佳學(xué)基因病源體基因檢測項目mNGS對現(xiàn)有技術(shù)的革新

1）傳統(tǒng)方法介紹

傳統(tǒng)的病源體檢測是采用涂片鏡檢的方法，是指將待檢樣品取材、制片后在顯微鏡下觀察、分析和判斷樣品中微生物種類的一種臨床診斷方法，通常用于疾病的初步判斷。人體的排泄物、分泌物或病患組織都可以作為檢查對象。常見的涂片鏡檢有革蘭氏染色法，可檢出革蘭氏陽性菌（如肺炎雙球菌、炭疽桿菌）、陰性菌（如百日咳桿菌、痢疾桿菌）。經(jīng)過包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等步驟后，革蘭氏陽性菌呈現(xiàn)紫色，革蘭氏陰性菌呈現(xiàn)紅色并且由于染色使得細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征更易于觀察，從而更利于分類鑒定。

生化方法是通過檢測微生物表達(dá)的特異性的酶，從而鑒定微生物種類的方法。使用特定的底物，檢測微生物代謝底物的能力，即可判斷微生物是否具有某種特定的酶。例如檢測沙門氏菌的辛酯酶法。各屬腸桿菌科細(xì)菌中只有沙門氏菌表達(dá)辛酯酶，根據(jù)這一特性，甄宏太等開發(fā)了快速檢測沙門氏菌的辛酯酶法。該方法是以42甲基傘形酮辛酯（MUCAP）為底物，在沙門氏菌的酶促反應(yīng)后，生成4MU，在紫外燈下可觀察到藍(lán)色熒光。該方法在數(shù)分鐘內(nèi)即可完成，適合病菌的初步篩查。

全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)是一種集生化反應(yīng)、計算機和自動化技術(shù)于一體的檢測技術(shù)，具有速度快，通量高的優(yōu)點。常見儀器如法國生物梅里埃公司的VITEK系統(tǒng)和美國BD公司的PHOENIX系統(tǒng)。自動化系統(tǒng)可進(jìn)行多達(dá)幾十種的微量生化反應(yīng)和藥敏生長試驗，根據(jù)各生化反應(yīng)孔中的生長變化及呈色反應(yīng)情況，由計算機通過數(shù)值編碼技術(shù)與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較分析，得到鑒定結(jié)果。

免疫學(xué)檢測是利用抗原和抗體在體外特異結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，對樣品中的抗原或抗體進(jìn)行定性、定量、定位的檢測。既可以檢測病原菌的抗原，也可以檢測免疫細(xì)胞的抗體?？乖瓩z測可以確認(rèn)病原菌，而抗體檢測則是病人健康評估的方法，兩者相輔相成。通常將待檢測的抗原（或抗體）結(jié)合蛋白預(yù)先連接上某種標(biāo)記物，借助標(biāo)記物的熒光或酶的有色反應(yīng)、放射性或高電子密度，在光鏡或電鏡下進(jìn)行定性、定位或定量研究。比如診斷肺炎時可通過肺炎鏈球菌和嗜肺軍團菌尿抗原檢測及血清隱球菌莢膜多糖抗原檢測診斷醫(yī)院獲得性肺炎。

微生物培養(yǎng)是通過培養(yǎng)樣品中的微生物再結(jié)合檢測液體菌液濃度（對應(yīng)固體培養(yǎng)基檢測菌落數(shù)）、或聯(lián)合生化或免疫學(xué)檢測對微生物進(jìn)行鑒定的方法。例如羅氏培養(yǎng)法可以用于診斷肺結(jié)核病。羅氏培養(yǎng)基可促進(jìn)分枝桿菌的生長并抑制其他雜菌，經(jīng)培養(yǎng)3-4周后分枝桿菌形成菌落，呈干燥顆粒狀，乳白色或米黃色，形似花菜心。

2）mNGS與傳統(tǒng)方法的比較

其他基于NGS方法介紹

PCR擴增后測序是擴增富集已知病原體基因片段之后再測序。由于只擴增部分基因，該方法的測序成本較mNGS更低。但該方法對于未知病源的感染無能為力。例如，16S rRNA是原核生物（比如細(xì)菌）核糖體的組成部分。核糖體是序列高度保守的基因，可將擴增引物設(shè)計在多物種共同的序列區(qū)域擴增16S rRNA片段，之后再測序、比對鑒定微生物類別。

目標(biāo)DNA區(qū)域捕獲并測序的方法與PCR擴增思路類似，通過篩選出部分基因進(jìn)行測序，從而降低成本。區(qū)別是篩選基因的方法：通過設(shè)計核酸探針（生物素標(biāo)記）互補結(jié)合到待測病原體的基因組區(qū)域，從而捕獲特定的病原體基因組片段，繼而對這些片段進(jìn)行測序。

mNGS與其他基于NGS方法的比較

1）新興方案介紹

PCR檢測技術(shù)是利用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)，在DNA聚合酶催化下，以樣品中提取的微生物基因組DNA為模板，選取特定微生物表達(dá)的特異基因設(shè)計引物，以是否能擴增出特異基因以及基因條帶的位置來鑒定病原微生物種類的方法。例如對布魯菌的bcsp31基因設(shè)計特異性引物再通過ＰＣＲ擴增可快速檢測血液、組織等標(biāo)本中是否含有布魯菌。

質(zhì)譜檢測技術(shù)通過對待測樣本進(jìn)行檢測，獲得其蛋白質(zhì)圖譜，再與已知微生物構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫的參考圖譜進(jìn)行比對，從而鑒定病原微生物的方法。

2）mNGS與其他新興方案的比較

mNGS在臨床中的應(yīng)用

mNGS具有檢測全面，正確率高，敏感度高和時間短的優(yōu)勢。鑒定樣品中病原微生物時，mNGS可以補充或替代傳統(tǒng)的生化、免疫和培養(yǎng)方法，更快更加正確地取得結(jié)果。更重要的是，傳統(tǒng)方法在應(yīng)對少見、罕見感染，新發(fā)性感染時常常束手無策，mNGS通過檢測樣品中全微生物物種，從而找出潛在的致病微生物，指導(dǎo)用藥。

在新發(fā)傳染病疫情中的應(yīng)用

在新發(fā)傳染病疫情的發(fā)現(xiàn)和控制中，mNGS發(fā)揮了越來越重要的作用。2011年德國產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC）O104：H4暴發(fā)，沒有相應(yīng)診斷試劑及標(biāo)準(zhǔn)可用于該新亞型，給檢測帶來了極大的難度。在多個高通量測序系統(tǒng)合力開展了宏基因組測序分析后，成功完成了菌株的基因組序列的重建，迅速確認(rèn)了致命德國腸出血性大腸桿菌O104：H4。至今，mNGS在多次疫情中檢測出致病菌，起到了鑒別病菌、控制疫情的作用。

在感染性疾病診斷中的應(yīng)用

mNGS用于感染性疾病的診斷新穎由加州大學(xué)Charles Y. Chiu團隊于2014年報道，發(fā)表在《英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》。1例14歲患者，頭痛、發(fā)熱反復(fù)住院8個月，在進(jìn)行了38種不同的診斷試驗（從血清學(xué)到培養(yǎng)和活檢），仍然無法明確其致病病原體，并進(jìn)入了昏迷狀態(tài)。賊終團隊使用mNGS檢測其腦脊液樣品，確診為鉤端螺旋體感染。隨即給予針對性的青霉素治療，32天后患者治好出院。此后該項技術(shù)廣泛用于多種感染性疾病的診斷。

在神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中mNGS的報道

據(jù)估計經(jīng)過全面深入的傳統(tǒng)檢查后仍有30%～60%的腦炎病例無法明確其病因。使用mNGS檢測可檢查出所有微生物，幫助診斷病毒性（DNA病毒和RNA病毒）腦炎。2015年，德國報道了3例基底節(jié)腦炎患者，患者臨床上以基底節(jié)病變?yōu)橹?，發(fā)病急驟，死亡率高，通過mNGS在腦內(nèi)檢測到松鼠博爾納病毒，這是新穎發(fā)現(xiàn)松鼠博爾納病毒傳染人類的證據(jù)。2015年，日本Sakiyama等報道了4例表現(xiàn)為腦脊髓膜炎的漁民，常規(guī)檢查未能明確其致病病原體，通過mNGS檢測發(fā)現(xiàn)其感染了以前從未曾報道的屬于古細(xì)菌域的嗜鹽菌（Halobacterium），在給予復(fù)方磺胺甲惡唑治療后患者有效好轉(zhuǎn)。上述報道均表明，mNGS檢測在診斷罕見的、新發(fā)的或不典型的病原微生物（如鉤端螺旋體、星狀病毒、古細(xì)菌、博爾納病毒）時發(fā)揮出了獨特的優(yōu)勢，可以有效檢測病原微生物并且指導(dǎo)用藥。

在呼吸道感染性疾病中mNGS的報道

在呼吸道感染中，除血液標(biāo)本外，mNGS已用于多種呼吸道多種標(biāo)本的檢測，包括痰、咽拭子、胸水、支氣管肺泡灌洗液、膿液及肺活檢標(biāo)本等。

謝云等報道了一項關(guān)于mNGS技術(shù)應(yīng)用于重癥肺炎的病原體檢測效果的回顧性研究，對照組及mNGS組共178例患者。對照組130例患者送檢痰、血及支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本做常規(guī)的微生物培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果調(diào)整抗菌藥物使用；mNGS組48例患者加做mNGS，根據(jù)mNGS檢測結(jié)果調(diào)整抗菌藥物的使用。賊后以28天，90天死亡率為指標(biāo)，mNGS組均顯著低于對照組，說明在mNGS結(jié)果的輔助下，患者的見效率顯著更高。胡必杰等報道了應(yīng)用mNGS檢測病原體的一項大樣本回顧性研究分析，納入可分析數(shù)據(jù)的511例患者。通過分析發(fā)現(xiàn)mNGS較傳統(tǒng)培養(yǎng)方法敏感性提高近15%。

在小兒感染性疾病中mNGS的報道

王春花等人基于NGS方法優(yōu)化的測序方法分別對94份重癥病例和150份輕癥病例臨床樣本進(jìn)行了測序分析，共檢出哺乳動物病毒科和植物病毒科共13種病毒。此外還檢測出了多種腸道病毒不同型別之間、腸道病毒與非腸道病毒之間的混合感染事件，為手足口病的臨床診斷提供了一種正確檢測方法。嚴(yán)重急性呼吸道感染（Severe Acute Respiratory Infection, SARI）是兒童住院和感染死亡的重要原因之一。王延群等人對135份SARI兒童和15份非SARI兒童的呼吸道樣品進(jìn)行了mNGS測序 ，檢測出病毒種類和主要病毒性病原，同時也通過比較病毒基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)感染組和對照組之間不同的病毒群落分布特點以及各個組內(nèi)的特異性病毒特征。

應(yīng)用病種流行病學(xué)特征

呼吸系統(tǒng)感染性疾病

國際呼吸協(xié)會論壇（Forum of International Respiratory Societies）于2017年發(fā)布了《全球呼吸道疾病概況》，介紹了全球前五大呼吸系統(tǒng)致死疾病的流行病學(xué)數(shù)據(jù)以及預(yù)防、控制和治療方案，其中包括感染類疾?。合潞粑栏腥竞头谓Y(jié)核。

下呼吸道感染和肺炎每年會導(dǎo)致全球多于四百萬人死亡，在低收入和中收入國家中尤其嚴(yán)重。2015年，有920,136名兒童（五歲以下，新生兒期以外）死于下呼吸道感染和肺炎，占該年齡段死亡人數(shù)的15%。這也是多年來早逝和住院治療的第二大原因。每年流感病毒會導(dǎo)致5-15%的人群下呼吸道感染并且有三至五百萬重癥患者。呼吸道合胞體病毒（RSV）是賊常見的引起兒童急性呼吸道感染的原因，每年近3400萬例，其中約90%RSV呼吸道感染死亡的兒童來自中低收入和中等收入國家。除RSV外，近幾十年也有新的呼吸系統(tǒng)病毒出現(xiàn)，如2003年爆發(fā)的SARS病毒。

肺結(jié)核的發(fā)病率在以每年1.5%的速度遞減，然而死亡率仍然高居不下，維持在17%。地區(qū)間死亡率差異較大，從5%到超過20%不等。2015年，肺結(jié)核共導(dǎo)致全球140萬人死亡，是賊大的單傳染源致死病和世界范圍內(nèi)賊大的致死疾病之一。2015年，合并HIV，肺結(jié)核的死亡人數(shù)達(dá)40萬人。肺結(jié)核病例主要分布在20個國家，其中非洲中部和東南亞區(qū)域發(fā)病率較高。2015年新增肺結(jié)核病例數(shù)1040萬例，其中100萬例是兒童，并且由于兒科肺結(jié)核病診斷難度大，此數(shù)字可能被低估。2015年估計新增案例中約58萬案例有耐藥性，11%合并HIV感染。

神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病

2018年6月，J Neurosurg雜志刊登了由哈佛醫(yī)學(xué)院的Faith C. Robertson、BS等人關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的研究。研究者對1990至2016年期間發(fā)表的關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病例的文獻(xiàn)進(jìn)行回顧和薈萃分析，統(tǒng)計了發(fā)病率，描述了地區(qū)分布情況。報告共涉及10萬個過往研究，共有約51萬個案例，共計1.3億人次。

根據(jù)世衛(wèi)組織對區(qū)域的劃分，非洲的細(xì)菌性腦膜炎發(fā)病率賊高（65例/100,000人），神經(jīng)囊尾蚴?。?50例/100,000人）和結(jié)核性脊柱炎（55例/100,000人），而東南亞的顱內(nèi)膿腫發(fā)病率賊高（49例/100,000人），歐洲非椎板性脊椎椎間盤炎的發(fā)病率賊高（5例/100,000人）。有限的死亡數(shù)據(jù)顯示結(jié)核性腦膜炎/脊柱椎間盤炎（21.1％）死亡率賊高，神經(jīng)囊尾蚴病賊低（5.5％）。

報告指出各類中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染疾病的發(fā)病率和國家/地區(qū)收入相關(guān)。發(fā)病率低等收入國家>中等收入國家>高等收入國家。
 

病原體基因檢測項目的樣本采集

1、腦脊液、胸腹水、組織內(nèi)濃液。直接在無菌下采集。采集后，需對采集管密封后，采用冷鏈在4度運輸；

2、組織塊：如考慮組織內(nèi)感染，可以取黃豆粒大組織塊，置于無菌組織管內(nèi)，干冰冷鏈運輸；

3、血液：采用帶有核酸保護液的STRECK抽取受檢者3-5ml靜脈血，采用4度冷鏈運輸；

4、組織、皮膚或者是器物表面：采用棉簽拭待測區(qū)域表面。每一個區(qū)域需采用2個棉拭子。盡量刮取較大區(qū)域。將棉拭子置于無菌管內(nèi)，采用4度運輸?shù)綄嶒炇摇?/p>