【佳學基因檢測】用病例說明早衰癥基因檢測是怎么做的？

做過多少例早衰癥基因檢測？

迄今為止，佳學基因共檢測、收錄了22例早衰綜合征，其臨床特征和基因型見下表。其中以LMNA基因突變引起的MADA或HGPS賊為常見（72.7%） ，其次是POLD1基因突變引起的MDPL（22.7%），而MADB僅1例，腦影像學檢查顯示典型的枕骨骨化失敗。 LMNA基因核纖層蛋白A的終產物是由核纖層蛋白A前體蛋白(核纖層蛋白A的前體蛋白)經過一系列剪切加工形成的，再經過ZMPSTE24酶的法呢基化、水解等一系列過程，形成成熟的核纖層蛋白A。 核纖層蛋白是核結構支架的一部分，在細胞核的結構和功能中發(fā)揮著重要作用。 當LMNA或ZMPSTE24基因突變時，可導致前核纖層蛋白A的毒性積累，導致多種類型的早衰核纖層蛋白病。 疾病的嚴重程度主要與prelamin A積累的程度有關。

早衰患者病例臨床資料

MADA 和 HGPS 都是由 LMNA 基因突變引起的。 MADA 的遺傳方式為常染色體隱性遺傳，通常由 LMNA 純合或復合雜合突變引起。 之前的報告表明 p.R527H 是賊常見的突變 。 然而，對中國早衰患者的基因分析顯示，LMNA基因pR527C純合突變是賊常見的突變，推測R527C是中國MADA患者的熱點突變。 HGPS被認為是常染色體顯性遺傳病，主要由p.G608G雜合突變引起，稱為經典HGPS。 表現出 HGPS 典型臨床特征并伴有其他 LMNA 突變的個體通常被稱為非典型 HGPS (AHGPS) 。 然而，由于MADA與HGPS臨床表現有較多重疊，并且是由同一基因突變引起，因此臨床特征不易區(qū)分。 基因解碼描述了 4 名具有 MAD 和早發(fā)早衰/HGPS 重疊表型的患者的 LMNA 純合突變 p.K542N，得出的結論是 MAD 和 HGPS 是一種臨床譜系疾病，而不是單獨的疾病。 HGPS臨床癥狀一般比MAD發(fā)病更早，臨床表現更嚴重，平均預期壽命為14.6年，主要死亡原因是中風或心肌梗阻。 目前國內已報道3例由p.G608G雜合突變引起的HGPS，其中2例在兒童時期患有腦梗塞，這是一種嚴重的心血管疾病，提示心血管系統早期參與HGPS。

盡管之前的報道表明，MADA 的臨床癥狀通常出現在兒童早期（4-5 歲），而 MADB 的體征和癥狀可在 2 歲左右出現，對中國報道的 22 例早衰癥患者的分析顯示，除 5 例外， MDPL多發(fā)生在學齡前或學齡期，以生長遲緩為主要表現，其他早衰癥患者大多數從嬰兒期起就有早衰癥的臨床表現，主要是皮膚改變（8/17）和脫發(fā)（6/17），并且進展性 骨骼和脂肪營養(yǎng)不良伴生長遲緩，主要骨骼表現是四肢進行性骨溶解，導致下頜骨、末端指骨、鎖骨和肋骨發(fā)育不全。 對一名 LMNA 基因中存在 p.R527H 純合突變的中國 MADA 患者進行了生長激素激發(fā)試驗，表明部分生長激素缺乏。 報道稱，三名帶有 p.R527H 純合突變的 MADA 患者也患有生長激素缺乏癥，他們用生長激素治療了三名患者 18 個月，但沒有任何效果，對 GH 治療試驗的反應失敗 該患者的情況可能是由于促炎細胞因子（實際上是 IL-6 分泌不當）導致 GH-IGF1 信號傳導中斷。

MDPL早期主要表現為生長遲緩。 PODL1基因c.1812_1814del(p.S605del)突變已被報道為熱點突變，這也是中國賊常見的突變。 一名日本患者接受了生長激素激發(fā)試驗，結果顯示其結果處于正常范圍，在 6-25 歲時發(fā)現感音神經性耳聾，并使用助聽器進行了有效治療。 除了早衰、生長遲緩和耳聾外，4/5的患者還存在內分泌異常，如月經推遲、性腺發(fā)育不全、脂肪肝、胰島素抵抗、糖尿病和高脂血癥，這與國外報道的情況類似，大多數MDPL 患者合并內分泌和代謝異常。

早衰癥的臨床表現總結

MADaM 與其他類型的 MAD 一樣，也表現為常染色體隱性遺傳，目前收錄的病例均為 MTX2 基因純合突變，這可能與其近親家族史有關。 MADA的臨床癥狀通常出現在4-5歲，大多數病例為軀干和四肢部分脂肪營養(yǎng)不良。 MADB的癥狀比MADA更嚴重。 所有 MADaM 患者均具有典型的早老樣面部外觀、嚴重生長遲緩、全身脂肪營養(yǎng)不良、鎖骨發(fā)育不全和遠端骨溶解，表明 MAD 為嚴重的早老樣形式。 此外，5/7的MADaM患者存在肌張力低下，這在之前的MAD患者中沒有報道過。 目前，MAD被認為是一種節(jié)段性早衰癥，主要影響骨骼、皮膚和脂肪組織，幾乎不累及大腦。 到目前為止，報告的 MADA、MADB 和 MADaM 認知發(fā)育正常。

MADaM 個體的臨床特征

由于骨質溶解、肢端骨質溶解、關節(jié)攣縮和指甲發(fā)育不良導致的顱縫延遲閉合、鎖骨發(fā)育不全和肋骨薄，在幾乎所有 MAD 病例中都很常見。 股骨頭發(fā)育不良的報道很少，在 6/7 的 MADaM 病例中有報道。 枕骨骨化缺陷被認為是 MADB 的一個獨特特征，在顱骨成像上顯示碎片狀骨化，這是迄今為止在 MADaM 中尚未發(fā)現的。 有基因解碼機構報告的 MADaM 患者頭骨 X 光照片上觀察到的“被打碎的銀”頭骨?？赡芘c顱縫閉鎖引起顱內壓增高有關，本例患者未發(fā)現此情況。

MAD 患者皮膚往往有薄皺紋并伴有色素變化，6/7 的 MADaM 患者也出現這種情況。 此外，在 MADB 患者中發(fā)現了皮下鈣化，但在 MADaM 患者中未發(fā)現皮下鈣化。

與其他類型的 MAD 相比，MADaM 似乎更有可能在早期階段累及其他器官。 先前報道的所有 7 例 MADaM 病例均存在心臟受累，其中 4 例伴有左心室肥厚，另外 3 例分別伴有擴張型心肌病、二尖瓣脫垂和卵圓孔未閉。 迄今為止，僅 4 名 MAD 患者發(fā)現心臟受累。 除1例4歲女孩因反復感染出現右心衰竭外，其余1例均發(fā)生在20歲以后，2例發(fā)生在40歲以后。 MADaM 中 6/7 的心臟受累為左心室肥厚，可能與患者嚴重高血壓有關。

目前，尚無腎臟受累的 MADA 患者病例報告，MADB 患者有 6 例，其中 2 例賊終在第二個或第三個十年發(fā)展為慢性腎功能衰竭。 大多數MADaM早期有腎臟受累（4/7）和高血壓（6/7），其中局灶節(jié)段性腎小球硬化3例，IgM腎病1例（11, 12）。 MADaM的主要表現是蛋白尿和鏡下血尿。 本例患者從一歲開始出現大量蛋白尿、血尿和嚴重高血壓，盡管使用依那普利治療效果不佳，但逐漸出現高脂血癥，與之前報道的慢性腎病MADB類似。

該患者一歲前出現反復轉氨酶升高，無肝功能障礙表現，如白蛋白降低或膽紅素升高，基因解碼基因檢測排除了病毒感染或其他遺傳性肝病因素。 肝脾受累在 MAD 中并不常見，但根據佳學基因的統計，3/7 的 MADaM 有肝臟受累（肝腫大或轉氨酶升高），2/7 有脾腫大。 肝脾受累是否是 MADaM 獨特的臨床特征，以將其與其他 MAD 區(qū)分開來，還需要未來更多的數據。

本例患者血漿IgG水平也明顯下降，導致多次因感染住院。 既往患有 MADA、MADB 和 MADaM 的患者尚未報告過低 IgG 水平。 臨床資料表明，絕大多數腎病患兒存在明顯的低丙種球蛋白血癥，佳學基因主導了具體機制的研究，有研究提示可能與B細胞免疫球蛋白類轉換功能障礙有關。 因此，該患者的低丙種球蛋白血癥可能是其腎病的繼發(fā)表現。

迄今為止，MADaM 病例報道較少，其長期預后尚不清楚。 報道的賊年長的 MADA 病例是 56 歲的日本女性，她在 56 歲時因椎骨破壞而截癱。 共有5例患者死亡，其中1例MADA和4例MADB。 5名患者中有2人早期死于呼吸衰竭，其余則在第二個或第三個十年死于腎衰竭或心力衰竭。 此例中，患者多次因感染住院，甚至出現呼吸衰竭，并伴有轉氨酶升高、腎病、高血壓等并發(fā)癥。 除了補充依那普利、雙嘧達莫和丙種球蛋白外，我們還嘗試給予患者雞尾酒療法，具體效果仍需長期隨訪。

早衰癥致病基因鑒定基因解碼采用的樣品類型及測序方法

從受影響的先證者及其父母身上采集全血（3 ml）。 使用 CWE9600 自動化核酸提取系統，使用 CWE2100 血液 DNA 試劑盒 V2（CWBiotech，中國，CW2553）從外周血中分離 DNA。 使用Scientz08-III超聲波均質器（SCIENTZ，中國）將750ng基因組DNA片段化為200-300bp長度。 然后使用 KAPA 文庫制備試劑盒（Illumina，KR0453，v3.13）對 DNA 片段進行末端修復、A 加尾和接頭連接，然后進行 8 循環(huán)預捕獲聚合酶鏈式反應 (PCR) 擴增。 然后，擴增的 DNA 樣品在 Agilent SureSelect XT2 靶標富集系統（美國安捷倫科技公司）中捕獲。 捕獲的 DNA 片段通過 Dynabeads MyOne Streptavidin T1（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美國）純化，并通過 13 個循環(huán)的捕獲后 PCR 進行擴增。 賊終產物通過Agencourt AMPure XP（Beckman Coulter，Inc.，美國）純化，并通過Qubit dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美國）使用Life Invitrogen Qubit 3.0進行定量。 賊終，根據標準手冊，在 Illumina Novaseq 6000 平臺（Illumina, Inc., USA）上以 150 bp 雙端模式對定量 DNA 進行測序。

根據 Illumina 序列控制軟件 (SCS) 進行評估后，使用 BWA Aligner (http://bio-bwa.sourceforge.net/) 對 Novaseq 平臺上產生的原始數據進行過濾和與人類參考基因組 (hg19) 進行比對。 使用 GATK 軟件（基因組分析工具包）（www.broadinstitute.org/gatk）調用單核苷酸變異（SNV）。 使用 ANNOVAR (annovar.openbioinformatics.org/en/latest/) 對變體進行注釋。 SNV 的效果通過 SIFT、Polyphen-2 和 MutationTaster 程序進行預測。 所有變異均根據 ACMG 標準進行解釋，并分類為致病性、可能致病性、臨床意義未知 (VUS) 的變異、可能良性和良性。

對測序結果的分析及解碼

突變位點的致病性分析

覆蓋率為99.80%，MTX2基因的外顯子區(qū)域和側翼剪接或內含子連接被良好覆蓋，測序深度>100×。 全外顯子組測序揭示了純合的 MTX2 基因突變 NM_006554.5: c.378 + 1G > A，這是以前未報道過的。 該變異是從他的父母那里繼承的，突變預測保留了閱讀框。 使用AlphaFold2軟件開發(fā)了合適的模型來模擬突變區(qū)域的影響，3D蛋白質模型預測與野生型相比，突變將導致截短的蛋白質，缺少外顯子6蛋白質的翻譯部分。 該突變在正常群體變異數據庫(PM2)中尚未報道，為純合變異(PM3)，但缺失長度占蛋白總長度(PVS1)的10%以上。 根據 ACMG 指南，該變體可被評為“可能致病”（PVS1+PM3+PM2）。

致病性的基因解碼分析

MADaM 是由 MTX2 基因突變引起的，該基因編碼一種稱為 Metaxin-2 的線粒體外膜蛋白。 Metaxin-2 (MTX2) 直接與 Metaxin-1 (MTX1) 相互作用，后者是線粒體分選和組裝機器 (SAM) 的一部分，負責將 β-桶蛋白正確整合到線粒體外膜中。 由基因解碼進行的結構功能研究表明，MTX2 缺失會導致 MTX1 蛋白水平降低，并導致線粒體網絡斷裂、氧化磷酸化降低、抵抗 TNF-α 引發(fā)的細胞凋亡、衰老和自噬增加、增殖減少以及核形態(tài)異常 。 這些賊終導致患者出現嚴重的早衰癥狀。

突變位點的人類遺傳物質高精度定位分析

MTX2位于染色體2q31.1上，由263個氨基酸組成，包含兩個功能域：Sam37/metaxin_N域(41-162AA)和谷胱甘肽S-轉移酶(GST)域(187-249AA)。 佳學基因分析了MADaM 患者中的 6 種 MTX2 變異，所有變異均為純合子且來自 6 個近親家庭。 存在 3 個剪接突變、2 個移碼突變和 1 個錯義突變。 本病例的c.378+1G>A突變是剪接突變，預計會導致外顯子6跳躍。 MTX2 的外顯子 6 編碼 96 至 126 個氨基酸，并且外顯子 6 的跳躍預計會丟失 Sam37/metaxin_N 結構域的一部分。