【佳學(xué)基因檢測(cè)】痛風(fēng)治療用藥指導(dǎo)基因檢測(cè)

遺傳病、罕見病基因檢測(cè)導(dǎo)讀：

痛風(fēng)治療用藥指導(dǎo)基因檢測(cè)藥物基因組學(xué)和基因診斷領(lǐng)域，涉及檢測(cè)HLA-B*5801等位基因的方法。檢測(cè)過程主要抱括取待測(cè)樣本DNA，用三對(duì)特異性引物和一對(duì)內(nèi)參引物，通過序列特異性引物法擴(kuò)增DNA片段后用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果。也可以在抽提樣本DNA后，用一對(duì)特異性引物、一對(duì)內(nèi)參引物和3條熒光探針，用Taqman探針法在熒光定量PCR儀上擴(kuò)增DNA片段，通過擴(kuò)增曲線分析結(jié)果。痛風(fēng)治療用藥指導(dǎo)基因檢測(cè)可結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳、高分辨率熔解曲線、SYBR Green熒光定量PCR等結(jié)果判讀工具，具有快速、簡(jiǎn)便、靈活、分辨率高、無污染等特點(diǎn)，適用檢測(cè)外周血、毛發(fā)等樣本中HLA-B*5801等位基因，用以判斷痛風(fēng)或高尿酸血癥患者服用別嘌呤醇后出現(xiàn)嚴(yán)重皮膚不良反應(yīng)的概率。

佳學(xué)基因關(guān)于痛風(fēng)用藥指導(dǎo)的知識(shí)介紹

隨著人們飲食中的高蛋白、高嘌呤、高熱量食物的攝入量的大幅上升，以及飲酒量(尤其是啤酒類)增加，活動(dòng)量減少等，導(dǎo)致了肥胖和代謝綜合征患者增加，使得伴隨的高尿酸血癥和原發(fā)性痛風(fēng)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)?；蚪獯a表明，痛風(fēng)是一種由于嘌呤物質(zhì)代謝異常，尿酸產(chǎn)生過多或因尿酸排泄不良而致血中尿酸升高，尿酸鹽結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)滑膜、滑囊、軟骨及其他組織中引起的反反復(fù)作性炎癥性疾病，其表現(xiàn)為患者關(guān)節(jié)活動(dòng)受限、熱、痛、腫，伴有關(guān)節(jié)畸形、結(jié)節(jié)性痛風(fēng)結(jié)石甚至腎臟病變，該疾患給患者帶來極大痛苦。

目前，臨床有關(guān)痛風(fēng)的治療原則除了嚴(yán)格的低嘌呤飲食、戒酒之外，消炎止痛藥和控制尿酸藥物的使用是必不可少的。治療痛風(fēng)的常用藥物包括秋水仙堿、非甾體類消炎藥、苯溴馬隆和別嘌呤醇(Allopurinol)等；秋水仙堿是目前治療痛風(fēng)的一線藥物，可抑制多核細(xì)胞移行至關(guān)節(jié)并抑制其吞噬功能，同時(shí)又抑制已進(jìn)入關(guān)節(jié)腔的細(xì)胞釋放乳酸和溶酶體酶，阻止細(xì)胞的有絲分裂，可迅速止痛。但是由于秋水仙堿對(duì)骨髓有直接抑制作用，可引起粒細(xì)胞缺乏、再生障礙性貧血等嚴(yán)重不良反應(yīng)，所以僅限于在痛風(fēng)急性發(fā)作期作為止痛藥物使用。苯溴馬隆和別嘌呤醇常用于痛風(fēng)癥狀緩解期，但兩者作用機(jī)理卻截然不同，其中，苯溴馬隆屬促尿酸排泄藥，對(duì)腎近曲小管尿酸鹽一陰離子交換系統(tǒng)有強(qiáng)而可逆的抑制作用，從而減少尿酸的重吸收，達(dá)到降低血尿酸的作用；別嘌呤醇為抵制尿酸合成的藥物，別嘌呤醇及其代謝產(chǎn)物氧嘌呤醇均能抑制黃嘌呤氧化酶，阻止次黃嘌呤和黃嘌呤代謝為尿酸，從而減少尿酸的生成，使血和尿中的尿酸含量減低到溶解度以下水平，防止尿酸形成結(jié)晶沉積在其他組織內(nèi)。作為尿酸合成過程賊后一步的抑制劑，別嘌呤醇是目前少數(shù)幾種能夠抑制尿酸生成的藥物之一； 在痛風(fēng)嚴(yán)重的時(shí)候與排尿酸藥苯溴馬隆合用，可加強(qiáng)療效；在對(duì)于尿酸生成過多、對(duì)排尿酸藥過敏或無效，以及不宜使用排尿酸藥物(如有腎功能不全)的原發(fā)性和繼發(fā)性痛風(fēng)病人，別嘌呤醇賊為適合(Hamburger et al., 2011)。

別嘌呤醇自1963年起用于臨床，其療效得到廣泛肯定，但部分患者服用別嘌呤醇后會(huì)出現(xiàn)以皮疹為主的不良反應(yīng)。事實(shí)上，所有的藥物都可能引起皮膚反應(yīng)，雖然大多比較輕微，一般停藥或常規(guī)抗過敏藥物治療即治好，但近5%的別嘌呤醇服用患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的皮膚不良反應(yīng)，包括Steven-Johnson綜合征(SJS)和中毒性表皮壞死松解癥(TEN)(Roujeau et al., 1995)。Steven-Johnson綜合征表現(xiàn)為嚴(yán)重的多形性紅斑,可累及皮膚與粘膜，包括口、鼻、眼、陰道、尿道、胃腸道和下呼吸道粘膜，患者甚至有失明之虞，進(jìn)一步發(fā)展則形成中毒性表皮壞死松解癥，全身黏膜潰爛，在紅斑上發(fā)生松弛性大泡或表皮剝離；若遇輕度觸碰或牽拉可導(dǎo)致表皮大面積剝離，據(jù)報(bào)道，SJS / TEN的致死率可達(dá)26%(Aubock & Fritsch, 1985; Arellano & Sacristan, 1993);因此，目前別嘌呤醇在臨床上的使用受到極大限制，但由于其作用機(jī)理的獨(dú)特性，對(duì)尿酸生成的抑制作用無其他藥物可以替代，其適應(yīng)癥患者只能冒著隨時(shí)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)服用該藥。同時(shí)，作為一種遲發(fā)型過敏反應(yīng)，所述SJS/TEN通常在服藥后數(shù)周才會(huì)出現(xiàn)癥狀，且患者出現(xiàn)皮炎后一般首先到皮膚科就診，一旦用藥史敘述不清，極易造成漏診、誤診，從而延誤停藥和治療的時(shí)機(jī)。

別嘌呤醇不良反應(yīng)受基因的影響

Hung等人(Hung ei 2005)在臺(tái)灣地區(qū)服用別嘌呤醇的痛風(fēng)患者中篩查了與藥物代謝和免疫應(yīng)答相關(guān)的823個(gè)SNP位點(diǎn)之后，發(fā)現(xiàn)與重癥藥疹呈強(qiáng)相關(guān)的SNP位點(diǎn)都位于MHC基因上，集中在HLA-A，B，C和DRBl基因座，尤其是HLA_B*5801等位基因，在服用別嘌呤醇后出現(xiàn)嚴(yán)重皮膚不良反應(yīng)的患者中100%存在，而在未出現(xiàn)皮膚不良反應(yīng)的患者(耐受人群)和正常對(duì)照組中，其攜帶率僅為15%和20% ;因此，越來越多的臨床醫(yī)師推薦在服用別嘌呤醇之前進(jìn)行HLA-B*5801等位基因檢測(cè)，以判斷是否屬有關(guān)高危人群；致力于有效降低由別嘌呤醇引起的嚴(yán)重不良反應(yīng)。

別嘌呤醇用藥指導(dǎo)基因檢測(cè)需要先進(jìn)的方法

通過基因解碼研究得知，人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,簡(jiǎn)稱HLA)復(fù)合體是當(dāng)前已知的人類染色體中基因密度賊高，也是多態(tài)性賊為豐富的區(qū)域；截止到2010年7月，世界衛(wèi)生組織HLA因子命名委員會(huì)命名的HLA-A、-B、-C、-DRBl、-DQBl等位基因已達(dá)到4836個(gè)；鑒于HLA系統(tǒng)的高度多態(tài)性和復(fù)雜性，決定了 HLA等位基因的檢測(cè)方法不同于普通多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)，主要圍繞特異性位點(diǎn)的判斷和相似等位基因的鑒別展開。

別嘌呤醇基因檢測(cè)方法介紹

(1) PCR- SBT法

即直接測(cè)序法。采用這一方法可以直接獲得DNA序列，鑒定所有存在的多態(tài)性，為賊直接、賊直觀的方法；但是，由于目的基因序列的特殊性、引物設(shè)計(jì)等多種因素，測(cè)序結(jié)果會(huì)出現(xiàn)套峰，不利于結(jié)果的判讀，使得PCR-SBT法存在著模棱兩可的結(jié)果，必要時(shí)需要人工判讀堿基序列(Adams et al., 2004)，且測(cè)序技術(shù)需要用到造價(jià)昂貴的測(cè)序儀，醫(yī)院內(nèi)通常不會(huì)配備；

(2)PCR-SSP法

檢測(cè)HLA_B*5801等位基因的方法，包括:獲得抽提的待測(cè)樣本DNA后，使用三對(duì)特異性引物和一對(duì)內(nèi)參引物，用序列特異性引物法(PCR-SSP )擴(kuò)增DNA片段后用瓊脂糖凝膠電泳或高分辨率熔解曲線分析擴(kuò)增結(jié)果。 在HLA-B基因多態(tài)性位點(diǎn)集中區(qū)域設(shè)計(jì)HLA-B*5801的三對(duì)特異性引物，其中，先進(jìn)條上游引物 Fl:5’ -CCGGGTCCGAGATCCGTCT-3’(序列 1)，第二條上游引物 F2:5’ -GGGCCGGAGTATTGGGATG-3’(序列 2)， 第三條上游引物 F3:5’ -accgagagaacctgcggat-3’(序列 3),通用下游引物 R:5，-gccatacatcctctggatga-3’(序列 4)；另外，使用Primer 3軟件在β-globin基因上設(shè)計(jì)內(nèi)參引物,其中，
上游引物 Globin-F:5’ -AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3’(序列 5)，下游引物 Globin-R:5’ -TTAGGGTTGCCCATAACAGC-3’(序列 6)；上述的三對(duì)特異性引物和一對(duì)內(nèi)參引物分別進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增后，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)每根PCR管中是否擴(kuò)增出目的條帶。在采用本方法中，三對(duì)特異性引物和一對(duì)內(nèi)參引物同時(shí)擴(kuò)增出特異性條帶，則代表待測(cè)樣本攜帶HLA-B*5801等位基因。