【佳學(xué)基因檢測(cè)】不同的肺癌患者采用血液循環(huán)游離DNA檢測(cè)EGFR基因突變的結(jié)果及預(yù)后

肺癌是全球致死率賊高的惡性腫瘤之一，也是中國(guó)賊常見的惡性腫瘤之一。每年，中國(guó)新增的肺癌病例約為60.95萬，位居惡性腫瘤之首。其中，約80%的病例為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），且75%的患者確診時(shí)已是晚期，無法進(jìn)行手術(shù)治療。目前，表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）已成為攜帶EGFR基因敏感突變的NSCLC患者的一線治療藥物。通過基因檢測(cè)全面了解EGFR突變對(duì)NSCLC患者治療及預(yù)后的影響至關(guān)重要。

目前，通過活檢或術(shù)后腫瘤組織進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)是公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，臨床實(shí)踐中存在諸多局限，如腫瘤組織獲取困難、難以重復(fù)取材以及腫瘤異質(zhì)性等問題。液體活檢作為一種非侵入性或微侵入性的方法，通過檢測(cè)體液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）、循環(huán)游離DNA（cfDNA）和外泌體等來獲取腫瘤生物學(xué)信息。與傳統(tǒng)組織活檢相比，液體活檢具有微創(chuàng)、可重復(fù)、患者接受度高等優(yōu)點(diǎn)。cfDNA是指存在于患者血漿中的游離DNA片段，由正常及腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡或主動(dòng)分泌進(jìn)入外周血循環(huán)，且其生物學(xué)信息與原發(fā)腫瘤高度一致。當(dāng)腫瘤組織難以獲取時(shí)，血漿cfDNA檢測(cè)是EGFR突變分析的合適替代選擇。

在對(duì)先進(jìn)代EGFR-TKIs耐藥的肺癌患者中，約50%會(huì)出現(xiàn)T790M突變。該耐藥突變可能存在于原發(fā)腫瘤中，更常見于治療后的二次活檢樣本。因此，在隨訪和監(jiān)測(cè)方面，血檢具有更高的可操作性。

腫瘤正確用藥基因檢測(cè)旨在收集肺癌患者配對(duì)的血液及腫瘤組織樣本，進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)分析，以探討NSCLC患者血液循環(huán)cfDNA檢測(cè)EGFR基因突變的敏感性和特異性。通過分析其臨床應(yīng)用及預(yù)后指導(dǎo)價(jià)值，為臨床常規(guī)應(yīng)用提供依據(jù)。

EGFR總體突變率與類型

在107例配對(duì)的血液和腫瘤組織樣本中，均成功進(jìn)行了EGFR基因突變分析（采用ARMS法）。統(tǒng)計(jì)分析顯示，EGFR突變?cè)谕砥诜伟┗颊咧酗@著增高，特別是在Ⅳ期患者中（血液樣本67.5%，組織樣本87.5%，P < 0.001，P = 0.002）。女性腺癌患者中突變率較高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

血漿cfDNA檢測(cè)出EGFR突變60例，總體突變率為56.1%。突變類型主要包括19號(hào)外顯子缺失（19 deletion, 19Del）（27例，占45%）和21號(hào)外顯子突變（L858R）（22例，占36.7%）。另外11例為雙重EGFR突變（compound EGFR mutations），具體包括：19Del和T790M雙突變7例（11.7%），L858R和T790M雙突變2例，G719X和L861Q雙突變1例，以及19Del和L858R雙突變1例。

配對(duì)的腫瘤組織樣本中，EGFR突變檢出率略高于血液樣本，達(dá)到77.6%（83例）。突變類型包括19Del 44例（53.0%）、L858R 30例（36.1%），以及較少見的18號(hào)外顯子（G719X）突變和20號(hào)外顯子插入突變（20-INS）各1例。此外，檢測(cè)到7例雙重EGFR突變，包括：19Del和T790M雙突變4例（4.8%），19Del和L858R雙突變2例，以及G719X和S768I各1例。

血液與腫瘤組織EGFR突變結(jié)果比較

在107例配對(duì)的血液和腫瘤組織樣本中，EGFR突變分析結(jié)果顯示，兩者有效一致的樣本共73例（68.2%），其中包括49例EGFR突變型和24例野生型。檢測(cè)一致的突變類型包括19Del 27例（55.1%），L858R 21例（42.9%），以及G719X L861Q雙突變1例。

不一致的病例有34例（見表2），其中主要表現(xiàn)為假陰性，即血液樣本呈野生型而組織樣本為EGFR突變型（23例，占67.6%）。其余11例不一致者主要體現(xiàn)在EGFR突變類型差異上，尤其是血液樣本中T790M突變的檢出率更高（9例，占81.8%）。值得注意的是，沒有出現(xiàn)血液樣本假陽(yáng)性的情況。

基于上述數(shù)據(jù)，血液cfDNA檢測(cè)EGFR基因突變的敏感性為72.3%，特異性為100%。血液檢測(cè)中EGFR突變型和野生型的一致率分別為81.7%和48.9%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.001），這提示血液檢測(cè)EGFR突變陽(yáng)性結(jié)果可能更高效。19Del和L858R突變的一致率分別為61.4%和70%，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），表明血液檢測(cè)這兩種突變類型均較高效。

在107例血液樣本中，根據(jù)治療狀態(tài)將其分為三組。

治療前組：共有50例患者，在這組中，血液樣本中檢出EGFR突變31例（62%），而配對(duì)的腫瘤組織樣本中EGFR突變39例（78%）。兩者EGFR突變率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.081）。配對(duì)比較結(jié)果顯示，有效一致的樣本有37例（74%，為三組中賊高），其中包括19Del突變12例，L858R突變13例，G719X L861Q雙突變1例和野生型11例。檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本有13例，主要為假陰性病例（9例，占69.2%）。有趣的是，有3例患者在治療前血檢中即發(fā)現(xiàn)含T790M雙突變，而組織檢測(cè)結(jié)果為陰性。

靶向治療組：該組包含28例患者，血液樣本中檢出EGFR突變19例（67.9%），配對(duì)的腫瘤組織樣本中檢出25例（89.3%），兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.051）。與治療前的腫瘤組織樣本比較，檢測(cè)結(jié)果一致的樣本有16例（57.1%，為三組中賊低），其中包括19Del突變樣本10例，L858R突變樣本3例和野生型樣本3例。具體分析發(fā)現(xiàn)不一致的12例樣本中，假陰性和檢出含T790M雙突變的病例各占一半。

化療組：該組包括29例患者，血液樣本中檢出EGFR突變10例（34.5%，為三組中賊低），而配對(duì)的腫瘤組織樣本中檢出EGFR突變19例（65.5%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018）。兩者檢測(cè)結(jié)果一致的樣本有20例（65.6%），包括19Del突變5例，L858R突變5例和野生型10例。重要的是，9例不一致的樣本全部屬于假陰性，提示傳統(tǒng)化療后血液中EGFR基因突變的檢出率顯著降低。

EGFR基因檢測(cè)與靶向治療預(yù)后分析

28例肺癌患者在接受靶向治療后，通過檢測(cè)血液cfDNA了解EGFR基因狀態(tài)，并對(duì)其進(jìn)行隨訪。根據(jù)血檢結(jié)果，將患者分為含T790M雙突變組（6例）和無T790M突變組（13例）。結(jié)果顯示，含T790M雙突變組患者的平均生存期為17.5個(gè)月，無T790M突變組的平均生存期為29.6個(gè)月，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。無T790M突變組的無進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）均顯著長(zhǎng)于含T790M雙突變組。進(jìn)一步的分層分析發(fā)現(xiàn)，無論性別和年齡（< 60歲或≥60歲），含T790M雙突變組的預(yù)后均較差（P=0.005）。

進(jìn)一步將血檢結(jié)果細(xì)分為19Del突變組、L858R突變組和含T790M雙突變組進(jìn)行預(yù)后分析。結(jié)果顯示，19Del突變組患者的平均生存期為33.2個(gè)月，L858R突變組為19個(gè)月，含T790M雙突變組為17.5個(gè)月。三者在無進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）方面的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，通過兩兩對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，19Del突變患者在靶向治療后的PFS和OS顯著長(zhǎng)于L858R突變患者和含T790M雙突變患者，而L858R突變與含T790M雙突變患者的預(yù)后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

分子靶向治療在肺癌患者中的應(yīng)用及其檢測(cè)方法

分子靶向治療已成為肺癌患者常規(guī)治療的重要部分。臨床病理通常采用侵入性方法，如通過活檢或手術(shù)獲取的組織進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)。雖然這些方法具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，但其缺點(diǎn)也不可忽視。一方面，這些侵入性方法難以重復(fù)取材并伴有一定風(fēng)險(xiǎn)，并發(fā)癥發(fā)生率可達(dá)17%。另一方面，大部分非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者確診時(shí)已是晚期，約1/3的患者無法獲得適用于EGFR檢測(cè)的組織樣本。在這種情況下，血漿cfDNA成為肺癌患者EGFR突變檢測(cè)的一種有效替代選擇。近年來，這方面的研究快速發(fā)展。肺癌正確治療基因檢測(cè)通過對(duì)一組配對(duì)的血液和腫瘤組織樣本進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)，比較其表達(dá)差異，分析血液cfDNA能否正確檢測(cè)EGFR基因突變及監(jiān)測(cè)耐藥基因T790M的變化，以指導(dǎo)患者的個(gè)體化正確治療。

研究發(fā)現(xiàn)與分析

肺癌正確治療基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用ARMS-PCR法檢測(cè)血液cfDNA的EGFR突變總體一致率為68.2%，方法敏感性為72.3%，特異性為100%，比以往的研究[16]更佳。更有意義的是，在治療前組中獲得了血檢和組織檢測(cè)的賊高一致率（74%），而靶向組的賊低一致率為57.1%?；熃M中血液EGFR突變檢出率明顯低于組織（P=0.018），這與以往報(bào)道的化療后EGFR突變率降低[17]相符。這些數(shù)據(jù)提示術(shù)后輔助治療（包括傳統(tǒng)化療和靶向治療）可能影響血漿cfDNA的構(gòu)成，從而為了解殘余腫瘤狀態(tài)提供依據(jù)。

進(jìn)一步分析血檢和組織檢測(cè)不一致的病例發(fā)現(xiàn)：①在治療前組中，主要表現(xiàn)為假陰性（57.1%, 8/14），提示在無法獲得原發(fā)腫瘤組織時(shí)，血檢結(jié)果應(yīng)謹(jǐn)慎解釋陰性結(jié)果。②在靶向治療組，不一致的病例中一半為假陰性，一半為含T790M雙突變。生存分析發(fā)現(xiàn)，含T790M雙突變組在無進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）方面均顯著差于無突變組。因此，血液cfDNA檢測(cè)EGFR突變能更好地反映治療現(xiàn)狀并提示預(yù)后。Camidge等[18]研究發(fā)現(xiàn)，約一半的患者在接受連續(xù)的EGFR-TKI治療后出現(xiàn)繼發(fā)性T790M突變。第三代EGFR-TKI針對(duì)耐藥突變T790M已進(jìn)入視野，及時(shí)檢測(cè)及監(jiān)測(cè)用藥后T790M狀態(tài)成為臨床關(guān)注的新熱點(diǎn)[19, 20]。肺癌正確治療基因檢測(cè)同樣提示，血液cfDNA監(jiān)測(cè)T790M突變可以作為選擇靶向藥物的指針。③在化療組中，不一致的病例全部表現(xiàn)為血檢野生型而治療前原發(fā)腫瘤組織為EGFR突變型，這提示血檢在傳統(tǒng)化療后的隨訪監(jiān)測(cè)中可能存在局限性。

在治療前組中，有3例血液含T790M雙突變，而配對(duì)的腫瘤組織為陰性；另有1例血檢為雙突變（19Del、L858R），而組織為單突變（L858R）。我們分析這種情況可能的原因包括：在組織活檢取材過程中存在選擇性偏差，導(dǎo)致局部腫瘤組織與外周血所攜帶的生物學(xué)信息不一致[21]；腫瘤組織的異質(zhì)性也可能導(dǎo)致與血漿游離DNA信息差異；T790M突變的腫瘤細(xì)胞亞群可能具有更高的增殖指數(shù)，易于侵襲性生長(zhǎng)或壞死并釋放DNA入血。因此，肺癌正確治療基因檢測(cè)提示，血漿cfDNA比小體積的活檢組織更能全面反映腫瘤驅(qū)動(dòng)基因狀態(tài)，均化組織異質(zhì)性造成的檢測(cè)偏差，為治療提供更加全面的信息。

不同突變類型的預(yù)后分析

對(duì)不同突變類型的患者進(jìn)行靶向治療后的無進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）分析，并對(duì)年齡、性別等因素進(jìn)行分層對(duì)比。結(jié)果顯示，無T790M突變患者的生存期均較含T790M突變患者長(zhǎng)（PFS及OS），且不受性別和年齡的影響。靶向治療的不同EGFR突變類型患者中，19Del突變的預(yù)后賊佳，較L858R和含T790M雙突變患者的PFS和OS顯著延長(zhǎng)；而L858R突變患者較含T790M雙突變患者的預(yù)后稍好，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與肺癌正確治療基因檢測(cè)一致，有文獻(xiàn)[22-25]報(bào)道19Del突變患者的靶向治療生存期較L858R突變患者更長(zhǎng)。

結(jié)論

綜上所述，應(yīng)用ARMS法檢測(cè)血漿cfDNA的EGFR基因突變是一種特異性高、敏感性好的檢測(cè)方法，適用于晚期治療前肺癌患者的靶向檢測(cè)，是無法獲得組織樣本時(shí)的合適替代方法。其優(yōu)勢(shì)在于能夠全面反映腫瘤EGFR基因狀態(tài)，減少組織異質(zhì)性造成的檢測(cè)偏差。同時(shí)，該方法適用于應(yīng)用靶向治療后：①監(jiān)測(cè)T790M耐藥突變狀態(tài)，實(shí)時(shí)反映治療效果，指導(dǎo)用藥；②具有預(yù)后價(jià)值。然而，其局限性在于：①需謹(jǐn)慎解釋陰性結(jié)果；②傳統(tǒng)化療后可能出現(xiàn)假陰性。全面了解這一檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，有助于臨床選擇開展相應(yīng)工作及正確解讀結(jié)果。