【佳學(xué)基因檢測(cè)】腫瘤靶向藥物阿來(lái)替尼(Alectinib)使用前基因檢測(cè)
為什么使用阿來(lái)替尼前需要進(jìn)行靶向藥物基因檢測(cè)?
酪氨酸激酶抑制劑間變性淋巴瘤激酶 (ALK-TKI)(包括阿來(lái)替尼)已成為 ALK 融合基因陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 的標(biāo)準(zhǔn)療法。在 NSCLC 中已發(fā)現(xiàn)多種 ALK 融合變異體,主要變異體為棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣 4-ALK (EML4-ALK) 變異體 1 (V1)、V2 和 V3a/b。然而,關(guān)于這些變異體對(duì) ALK-TKI 的臨床反應(yīng)的報(bào)道存在爭(zhēng)議,關(guān)于其他不太常見(jiàn)的 ALK 變異體的報(bào)道較少。為了檢驗(yàn) ALK 變異體對(duì) ALK-TKI 療效的影響,腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是分析了 8 種 ALK 變異體對(duì)阿來(lái)替尼的敏感性:3 種主要變異體(V1、V2 和 V3a)和 5 種不太常見(jiàn)的變異體(V4;驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員 5-ALK;驅(qū)動(dòng)蛋白輕鏈 1-ALK;紋狀體、鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白-ALK;和原肌球蛋白受體激酶融合基因-ALK)。使用重組蛋白進(jìn)行無(wú)細(xì)胞激酶測(cè)定,并使用表達(dá) ALK 變異體的小鼠 Ba/F3 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定。每種重組蛋白的激酶活性都被阿來(lái)替尼顯著抑制。在每個(gè)表達(dá) ALK 變異體的 Ba/F3 細(xì)胞中,阿來(lái)替尼抑制了細(xì)胞內(nèi) ALK 磷酸化水平及其下游信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì) STAT3 和 ERK。每種細(xì)胞的增殖均受到阿來(lái)替尼治療的顯著抑制。細(xì)胞之間的 IC 50值沒(méi)有顯著差異,反應(yīng)性差異小于 3.6 倍??傊?,這八種 ALK 變異體在體外對(duì)阿來(lái)替尼的敏感性相似,這表明可能無(wú)法僅通過(guò)確定 ALK 融合陽(yáng)性 NSCLC 中的 ALK 變異體類型來(lái)預(yù)測(cè)對(duì)阿來(lái)替尼的反應(yīng)。
腫瘤靶向藥物阿來(lái)替尼(Alectinib)使用前基因檢測(cè)關(guān)鍵詞
阿來(lái)替尼、ALK、EML4、融合、KIF5B、KLC1、肺癌、STRN、TFG、變異
不同的肺癌患者具有不同的基因突變,可以由肺癌基因檢測(cè)進(jìn)行明確
不同的肺癌患者有不同的基因突變,使得它們對(duì)靶向藥物的敏感性不同。根據(jù)《腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)》,8% 的非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 患者發(fā)生間變性淋巴瘤激酶 (ALK) 基因重排。研究發(fā)現(xiàn),ALK 融合陽(yáng)性 (ALK+) NSCLC 患者接受 ALK 酪氨酸激酶抑制劑 (ALK-TKI) 治療后臨床結(jié)局有所改善,這促使克唑替尼、色瑞替尼、阿來(lái)替尼、布格替尼和勞拉替尼等藥物獲得批準(zhǔn)。在 ALK+ NSCLC 中已發(fā)現(xiàn) 90 多種不同的 ALK 融合變體。賊常見(jiàn)的變異是棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣 4 (EML4)-ALK 變異 1 (V1)、變異 2 (V2) 以及變異 3a 和 3b (V3a/b),它們是由 2 號(hào)染色體上與 ALK 融合的 EML4 在不同斷點(diǎn)處發(fā)生倒位引起的;這些變異的發(fā)生頻率分別為 42.7%、10.5% 和 37.1% 。
在先前的克唑替尼或勞拉替尼臨床研究中,V3a/b 患者的無(wú)進(jìn)展生存期 (PFS) 似乎明顯短于 V1 患者。然而,這些結(jié)果與其他克唑替尼或阿來(lái)替尼研究的結(jié)果相沖突,這些研究報(bào)告稱 V1、V2 和 V3a/b 患者的 PFS 差異并不顯著。此外,目前可用的臨床數(shù)據(jù)非常有限,無(wú)法檢查次要罕見(jiàn) ALK 變異(約占除 V1、V2 和 V3a/b 以外所有變異的 10%)是否影響對(duì) ALK-TKI 的療效。
在這項(xiàng)臨床前研究中,腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)分析了阿來(lái)替尼對(duì)主要 ALK 變異以及次要變異的影響。腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)選擇了 ALK + NSCLC 中的八種不同的 ALK 融合變異:V1;V2;V3a;EML4-ALK 變異 4 (V4);驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員 5 (KIF5B)-ALK;驅(qū)動(dòng)蛋白輕鏈 1 (KLC1)-ALK;紋狀體、鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白 (STRN)-ALK;和原肌球蛋白受體激酶融合基因 (TFG)-ALK。
阿來(lái)替尼抑制細(xì)胞內(nèi) ALK 變體的激酶活性
為了評(píng)估阿來(lái)替尼對(duì) ALK 變體細(xì)胞內(nèi)激酶活性的影響,腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是通過(guò)將含有每種變體的載體單獨(dú)轉(zhuǎn)染到小鼠 Ba/F3 細(xì)胞系中,建立了八種穩(wěn)定細(xì)胞,每種細(xì)胞表達(dá)八種 ALK 變體中的一種。腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是還通過(guò)轉(zhuǎn)染空載體建立了穩(wěn)定的對(duì)照細(xì)胞。由于載體中的新霉素抗性基因也由細(xì)胞中的組成型啟動(dòng)子持續(xù)轉(zhuǎn)錄,因此新霉素抗性基因的 mRNA 表達(dá)水平被認(rèn)為是估計(jì)轉(zhuǎn)染后每個(gè) Ba/F3 細(xì)胞中載體和 ALK 變體基因拷貝數(shù)的良好標(biāo)記。九種細(xì)胞之間的新霉素抗性基因 mRNA 水平差異不顯著,表明每種 ALK 變體的 mRNA 表達(dá)水平也幾乎相同。在所有八種 ALK 變體細(xì)胞中,阿來(lái)替尼均抑制了細(xì)胞內(nèi) ALK 變體及其下游信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì) STAT3 和 ERK 的磷酸化水平。此外,ULK1的Ser757磷酸化受到抑制,并且所有變異細(xì)胞中的MCL-1蛋白水平均被阿來(lái)替尼下調(diào)。ULK1 Ser757 磷酸化降低促進(jìn)自噬,MCL-1 是抗凋亡的 Bcl-2 家族成員之一,這表明阿來(lái)替尼可在每種變異細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬起始和凋亡,無(wú)論 ALK 變異類型如何。因此,不僅主要 ALK 變異體 V1、V2 和 V3a,而且次要變異體 V4、KIF5B-ALK、KLC1-ALK、STRN-ALK 和 TFG-ALK 都具有組成性激酶活性,從而通過(guò) STAT3、ERK 或 ULK1 激活下游致癌信號(hào)傳導(dǎo)。然而,無(wú)論 ALK 變異類型如何,阿來(lái)替尼都可以通過(guò)抑制 ALK 磷酸化來(lái)抑制這些信號(hào)通路。
阿來(lái)替尼抑制 ALK 變異細(xì)胞的增殖
賊后,腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是研究了阿來(lái)替尼對(duì)表達(dá) ALK 變體的 Ba/F3 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。阿來(lái)替尼治療 4 天后,這些表達(dá) ALK 變體的細(xì)胞的增殖以劑量依賴性方式顯著受到抑制,它們的IC 50值沒(méi)有顯著差異,響應(yīng)性差異<3.6倍。在賊大劑量1000 nM阿來(lái)替尼下,對(duì)照細(xì)胞的增殖抑制率不足40%。腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是通過(guò)使用雙熒光染料染色吖啶橙和 DAPI 直接計(jì)數(shù)活細(xì)胞和非活細(xì)胞的數(shù)量來(lái)研究細(xì)胞死亡。用 10 nM 的阿來(lái)替尼處理 4 天后,所有變體細(xì)胞的細(xì)胞死亡率沒(méi)有顯著差異。與阿來(lái)替尼一樣,克唑替尼治療 4 天也以劑量依賴性方式顯著抑制每種 ALK 變體的細(xì)胞增殖, 且它們之間的IC 50值沒(méi)有顯著差異。接下來(lái),腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是研究了在半固體瓊脂培養(yǎng)基中用阿來(lái)替尼預(yù)處理 24 小時(shí)對(duì) 6 天培養(yǎng)中菌落形成的影響。V1、V2、V4、KLC1-ALK、STRN-ALK 變體細(xì)胞的每個(gè)菌落均被用阿來(lái)替尼預(yù)處理有效阻斷。無(wú)論是否接受阿來(lái)替尼預(yù)處理,V3a、KIF5B-ALK、TFG-ALK 變異細(xì)胞中均無(wú)菌落。這些結(jié)果表明,無(wú)論 ALK 變異類型如何,所有八種 ALK 變異表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)均會(huì)立即受到 ALK-TKI 治療的抑制,且抑制效果相似。
阿來(lái)替尼抑制對(duì)具有特定基因突變的腫瘤細(xì)胞的使用效果總結(jié)
腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是發(fā)現(xiàn) ALK 融合變體的類型(V1、V2、V3a、V4、KIF5B-ALK、KLC1-ALK、STRN-ALK 或 TFG-ALK)不會(huì)影響 ALK 變體轉(zhuǎn)化的 Ba/F3 細(xì)胞的阿來(lái)替尼敏感性,IC 50值表明所有變體之間的反應(yīng)性差異并不顯著,<3.6 倍。
先前有兩項(xiàng)研究使用細(xì)胞增殖測(cè)定法對(duì)與腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是研究相同的 Ba/F3 細(xì)胞進(jìn)行研究,但結(jié)果不一致。Heuckmann等人報(bào)道,表達(dá) V3a 的細(xì)胞的 IC 50比表達(dá) V2 的細(xì)胞高 6.7 倍以上 ;Woo等人報(bào)道,表達(dá) V3a 的細(xì)胞的 IC 50比表達(dá) V1 或 V2 的細(xì)胞高 11.8 倍以上,這表明表達(dá) V3a 的細(xì)胞對(duì)阿來(lái)替尼的耐藥性比表達(dá) V1 或 V2 的細(xì)胞更強(qiáng)。雖然造成這種矛盾的具體原因尚不清楚,但考慮到據(jù)報(bào)道ALK融合基因的擴(kuò)增會(huì)在 ALK + H2228 細(xì)胞中誘導(dǎo)克唑替尼耐藥性,結(jié)果可能受到每種 ALK 變體基因表達(dá)水平差異的影響。此外,V1、V2 和 V3a 變體之間的周轉(zhuǎn)率以及細(xì)胞內(nèi) ALK 融合蛋白的不穩(wěn)定性也可能存在顯著差異。
因此,為了更正確地闡明阿來(lái)替尼敏感性的差異,腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是認(rèn)為不僅需要調(diào)整每種 ALK 變體蛋白的水平,還需要調(diào)整所有八種 ALK 變體表達(dá)細(xì)胞的基因表達(dá)水平。在本研究中,腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是同時(shí)將每種變體電穿孔到 Ba/F3 細(xì)胞中,并成功制備了八種 ALK 變體表達(dá)細(xì)胞,通過(guò)測(cè)量新霉素抗性基因的表達(dá)來(lái)估計(jì),它們之間每種 ALK 變體基因的表達(dá)量沒(méi)有顯著差異。如果每種變體的表達(dá)水平嚴(yán)重不平衡,則可能推斷出高表達(dá)的變體對(duì)阿來(lái)替尼的敏感性低于低表達(dá)的變體,無(wú)論 ALK 變體的類型如何。這一假設(shè)可能部分解釋了他們的結(jié)果與腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是在 V1、V2 和 V3 對(duì)阿來(lái)替尼的反應(yīng)方面的不一致。然而,腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是的體外模型結(jié)果顯示,V1、V2 和 V3a 等 8 種 ALK 變異體對(duì)阿來(lái)替尼的敏感性無(wú)顯著差異,這與賊近一項(xiàng)阿來(lái)替尼一線治療的 III 期試驗(yàn)中觀察到的臨床反應(yīng)一致,該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) V1、V2 或 V3a/b 變異體患者之間的客觀緩解率沒(méi)有顯著差異。
在ALK+ NSCLC患者中,已鑒定出近90種ALK融合變異體,除主要的V1、V2和V3a/b變異體之外,幾乎所有變異體對(duì)艾樂(lè)替尼的臨床反應(yīng)尚不清楚。約17%的ALK+ NSCLC患者對(duì)艾樂(lè)替尼無(wú)反應(yīng),其反應(yīng)不佳的原因也不明。在目前的臨床前研究中,不僅三種主要變異體對(duì)艾樂(lè)替尼或克唑替尼敏感性無(wú)顯著影響,五種不常見(jiàn)變異體(V4、KIF5B-ALK、KLC1-ALK、STRN-ALK和TFG-ALK)對(duì)艾樂(lè)替尼或克唑替尼敏感性亦無(wú)顯著影響。因此,這五種變異至少可能不會(huì)導(dǎo)致 ALK + NSCLC 患者對(duì)阿來(lái)替尼的臨床反應(yīng)出現(xiàn)任何差異,并且在腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是推測(cè)臨床反應(yīng)和 ALK 變異之間的任何相關(guān)性之前,還需要對(duì)除此處測(cè)試的八種類型之外的各種 ALK 變異表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步研究。
腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是的研究有幾個(gè)局限性。首先,ALK 變體的數(shù)量有限。由于實(shí)驗(yàn)上很難建立大量表達(dá)幾乎等同的 ALK 變體的 Ba/F3 細(xì)胞,因此腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是在本研究中選擇了八種 ALK 變體。其次,腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是沒(méi)有直接測(cè)量細(xì)胞中的 ALK 變體基因表達(dá),因?yàn)槊糠N ALK 變體 mRNA 的穩(wěn)定性未知。然而,由相同組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的新霉素抗性基因存在于八個(gè) ALK 變體載體中的每一個(gè)中。因此,腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是通過(guò)測(cè)量常見(jiàn)新霉素抗性基因的表達(dá)水平間接衡量了每個(gè) ALK 變體基因的表達(dá)。第三,腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是用小鼠細(xì)胞系 Ba/F3 而非人類細(xì)胞系構(gòu)建了表達(dá) ALK 變體的細(xì)胞,盡管腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是認(rèn)為 Ba/F3 細(xì)胞適合本研究,因?yàn)樗鼈円言谥暗难芯恐杏糜跈z查融合基因激酶活性,例如 ALK 或 ROS1 或 RET。為了克服這些限制,并在體外繪制出所有 ALK 融合變體對(duì)阿來(lái)替尼敏感性的完整圖譜,使用 Ba/F3 細(xì)胞和人肺上皮 BEAS-2B 細(xì)胞測(cè)試盡可能多的 ALK 變體將會(huì)很有用。
總之,八種 ALK 變異體(V1、V2、V3、V4、KIF5B-ALK、KLC1-ALK、STRN-ALK 和 TFG-ALK)的激酶活性被阿來(lái)替尼顯著抑制,表達(dá)每種變異體的細(xì)胞對(duì)阿來(lái)替尼治療的敏感性沒(méi)有顯著差異。腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是的研究結(jié)果表明,無(wú)論 ALK 變異體的類型如何,攜帶這八種 ALK 融合變異體之一的 NSCLC 患者對(duì)阿來(lái)替尼的反應(yīng)也可能相似,并且這些變異體的差異可能對(duì) ALK 融合陽(yáng)性 NSCLC 患者的阿來(lái)替尼反應(yīng)影響不大。此外,由于臨床上僅檢測(cè)到非常有限數(shù)量的罕見(jiàn) ALK 融合變異體,腫瘤基因解碼基因檢測(cè)是在本研究中構(gòu)建的臨床前模型可能是研究這些次要變異體對(duì)阿來(lái)替尼治療的臨床反應(yīng)的有用工具。
(責(zé)任編輯:佳學(xué)基因)