【佳學(xué)基因檢測】血漿DNA的外顯子組測序揭示了哌柏西 palbociclib加氟維司群治療后的基因變化

在參加 PALOMA-3 研究的 521 名患者中，有 459 名患者有可用的基線（治療第 1 天）血漿樣本，其中 287 名患者具有匹配的治療結(jié)束（EOT）。 與整個 PALOMA-3 研究人群相比，來自該組的配對樣本患者具有相似的 palbociclib 益處。 在沒有可用的匹配治療結(jié)束樣本的患者 (n = 172) 中，94 例沒有進(jìn)展 (94/172, 54.6%)，而匹配組中有 74 例 (74/287, 25.8%)。 腫瘤基因解碼首先確定配對的第 1 天和 EOT 樣本用于血漿 DNA 外顯子組測序，以實現(xiàn)對 palbociclib 加氟維司群的進(jìn)展遺傳事件的綜合評估（圖 1A）。 為了鑒定具有足夠腫瘤純度的配對血漿樣本用于外顯子組測序，我們開發(fā)了一種新的拷貝數(shù)和純度靶向測序策略，使用靶向擴(kuò)增子組，該組包括乳腺癌中常見缺失區(qū)域的大約 1000 個單核苷酸多態(tài)性 (SNP)（參見材料和 方法)，并將其與 PIK3CA 和 ESR1 突變的數(shù)字 PCR 數(shù)據(jù)相結(jié)合 (13)。 使用這種方法，乳腺癌靶向藥物基因檢測確定了 16 名接受 palbociclib 加氟維司群治療的患者，他們在第 1 天和 EOT 時血漿中具有高腫瘤 DNA 純度（>10% 腫瘤純度），具有足夠的外顯子組文庫制備材料。 其中，9/16 (56.3%) 在第 1 天的 ctDNA 中有 PIK3CA 突變，6/16 (37.5%) 有 ESR1 突變。 五名患者具有匹配的種系 DNA，另外 3 個不匹配的種系 DNA 樣本也被測序以擴(kuò)大種系面板以過濾測序噪音。 由于只有來自氟維司群加安慰劑組的 6 名患者具有符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的匹配樣本，因此未對這些患者進(jìn)行測序。

圖1：配對的循環(huán)腫瘤 DNA (ctDNA) 外顯子組測序揭示了氟維司群和哌柏西利的頻繁克隆選擇

A – 使用液滴數(shù)字 PCR 和靶向 SNP 測序方法篩選來自 PALOMA-3 試驗的第 1 天和治療結(jié)束時的血漿樣本，以確定來自 palbociclib 加氟維司群組的患者，這些患者的血漿樣本具有足夠的腫瘤純度（>10% ) 用于血漿外顯子組測序。

 

B – 對 390 號患者進(jìn)行的配對 ctDNA 外顯子組測序分析了克隆組成。 在 EOT 處檢測到新出現(xiàn)的 RB1 突變克隆，其中包含兩個失活的 RB1 突變。

 

C – 來自 ctDNA 的患者 390 的乳腺癌系統(tǒng)發(fā)育樹推斷。 黃色 - 存在于所有癌細(xì)胞中的軀干突變； 第 1 天出現(xiàn)的紫色亞克隆隨后在治療中消退：灰色 - 一種新出現(xiàn)的抗性克隆，其特征在于兩個 RB1 突變，分別產(chǎn)生于紫色亞克隆。

 

D – 在患者 390 的每個亞克隆中識別的突變特征的表示。原始數(shù)據(jù)顯示在補充表 3 中。

 

E – 在患者 390 的抗治療亞克隆中鑒定的兩個 RB1 突變 Q257X 和 N519fs 的數(shù)字 PCR 驗證。顯示第 1 天和 EOT 的結(jié)果，Y 軸突變體探針幅度和 X 軸野生型探針幅度。

 

F – 患者 253 的配對 ctDNA 外顯子組測序分析了克隆組成。 在 EOT 檢測到在第 1 天檢測不到的新 FGFR2 突變體克隆。

 

G——從 ctDNA 中推斷出的來自患者 253 的乳腺癌系統(tǒng)發(fā)育樹。 黃色 - 存在于所有癌細(xì)胞中的軀干突變； 紫色 - 以第 1 天出現(xiàn)的 ESR1 D538G 突變?yōu)樘卣鞯膩喛寺。S后在治療中消退； 橙色——以 FGFR2 激酶結(jié)構(gòu)域突變?yōu)樘卣鞯男鲁霈F(xiàn)的抗性克隆，與紫色亞克隆分開產(chǎn)生； 灰色——由以 Q75E ESR1 突變?yōu)樘卣鞯?FGFR2 突變亞克隆產(chǎn)生的亞克隆。

 

H – 在來自患者 253 的每個個體克隆中識別的突變特征的表示。原始數(shù)據(jù)顯示在補充表 3 中。

 

I – 來自患者 253 的 FGFR2 突變的數(shù)字 PCR 驗證顯示第 1 天和 EOT 的血漿結(jié)果。

 

EOT – 治療結(jié)束，HR – 同源重組，MMR – 錯配修復(fù)，ctDNA – 循環(huán)腫瘤 DNA

血漿 DNA 外顯子組測序的中位深度為 164X（范圍 139-212），種系 DNA 的中位深度為 47X（范圍 34-58）。 第 1 天的兩個樣品有污染證據(jù)，這些對被排除在比較、配對分析之外。 第 1 天樣本中可檢測到的非同義變異的數(shù)量在患者之間差異很大（范圍 19 – 254）。 對所有樣本的突變特征分析表明，最普遍的是特征 1（年齡）和 3（同源重組缺陷），這與現(xiàn)有的乳腺癌數(shù)據(jù)一致 (16)。 第 1 天的外顯子組測序數(shù)據(jù)還揭示了除 ESR1 突變外可能與內(nèi)分泌耐藥性發(fā)展相關(guān)的遺傳標(biāo)記——4/14 (28.6%) 患者的 NOTCH 家族受體 NOTCH2、NOTCH3 和 NOTCH4 突變，以及 2/14 患者的 NF1 突變 (14.3%)。 大多數(shù)患者的基因組不穩(wěn)定性指數(shù)在第 1 天和治療結(jié)束之間大致穩(wěn)定，但從突變負(fù)荷來看，患者之間存在相當(dāng)大的差異。

在第 1 天和 EOT 血漿中，85.7% 12/14 患者的克隆進(jìn)化和選擇在 palbociclib 加氟維司群中明顯可見（圖 1）。 390 號患者有兩個 RB1 截短突變，p.Q257X 和 p.N519fs，僅在治療結(jié)束時檢測到（圖 1B）。 使用 PyClone 進(jìn)行的克隆性分析 (17) 表明這些 RB1 突變存在于耐藥亞克隆中，或者可能是平行進(jìn)化導(dǎo)致表型收斂的獨立亞克隆，進(jìn)一步的治療敏感亞克隆明顯以 RUNXT1 突變?yōu)樘卣?，該突變在治療后退化（圖 1C). 由 PyClone 模型確定的每個亞克隆的突變計數(shù)為 155（簇 1）、64（簇 2）和 51（簇 3）。 抗性亞克隆中的突變主要與 APOBEC 突變特征一致（圖 1D，補充表 3）。 RB1 突變通過數(shù)字 PCR 驗證，并確認(rèn)在治療開始時不存在（圖 1E）。

第二名患者，253，在使用 palbociclib 加氟維司群治療期間表現(xiàn)出明顯的亞克隆選擇，該亞克隆具有 FGFR2 p.K569E 酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中的激活突變，在第 1 天樣本中未檢測到（圖 1F）。 由 PyClone 模型確定的每個亞克隆的突變計數(shù)為 51（簇 1）、49（簇 2）、54（簇 3）和 20（簇 4）。 新的顯性抗性亞克隆，以及一個額外的 ESR1 突變體 Q75E 子克隆，取代了第 1 天 ESR1 D538G 突變體克隆，該克隆被處理負(fù)選擇（圖 1G）。 由于 Q75E 不是公認(rèn)的芳香化酶抑制劑耐藥性原因，并且位于 ESR1 的配體結(jié)合域之外，因此本病例中的這些發(fā)現(xiàn)表明，第 1 天和 EOT 之間顯性 ESR1 突變的變化可能反映了亞克隆選擇可能與功能性無關(guān) ESR1 突變的后果，不同的 ESR1 突變標(biāo)記單個克隆而不是潛在出現(xiàn)的抗性克隆。 正如患者 390 中的耐藥亞克隆所見，患者 253 中新顯性 FGFR2 突變亞克隆也有很大一部分突變與 APOBEC 特征一致，次要子克隆突變以錯配修復(fù)特征為主（圖 1H） ). FGFR2 突變的選擇通過數(shù)字 PCR 驗證（圖 1I）。 在另外三名患者中，可能有證據(jù)表明在抗原呈遞途徑中選擇了緊急突變。

這些發(fā)現(xiàn)表明，在使用哌柏西利聯(lián)合氟維司群的乳腺癌中，克隆進(jìn)化很常見，有證據(jù)表明，出現(xiàn)的亞克隆的基因組可塑性可以由治療開始時占主導(dǎo)地位的大量疾病的不同突變過程驅(qū)動。

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