【佳學(xué)基因檢測】多基因檢測血液分析在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤診斷和治療中的臨床應(yīng)用

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤疾病的當(dāng)前臨床狀況

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤 (NEN)，也稱為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤 (NET)，通常稱為“類癌”，代表一系列具有多種分子異常的腫瘤，這些異常具有共同的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞起源(表格1）。在解剖學(xué)上，病變起源于肺、胃腸道和胰腺的彌漫性神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)以及離散器官部位，例如胸腺、垂體和腎上腺。在功能上，它們產(chǎn)生多種生物活性胺和肽。正如可以預(yù)測的那樣，鑒于所涉及的細(xì)胞和腫瘤類型不同，它們的 5 年生存率與其臨床表現(xiàn)的差異一樣大（15%–95%）?？傮w而言，這反映了腫瘤的生物異質(zhì)性（不同的細(xì)胞類型、不同的分子調(diào)控機制和不為人知的致癌驅(qū)動因素），實際上，這表明這些腫瘤通常與它們假定的共同起源細(xì)胞之間幾乎沒有關(guān)系. 

表格1:神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤生物標(biāo)志物的生物學(xué)和臨床應(yīng)用

a僅對癥治療。

b僅在特定情況下，例如胃泌素瘤/胰島素瘤。

c檢測技術(shù)識別 EPCAM（上皮細(xì)胞粘附分子）。

他們的管理反映了通常基于當(dāng)?shù)貙嵺`經(jīng)驗、卓越醫(yī)學(xué)或某些療法或藥物研究的可用性的各種方法。盡管分類系統(tǒng)和令人厭煩的指南不斷發(fā)展（例如，世界衛(wèi)生組織和歐洲神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤學(xué)會），很少有基于證據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化方法，特別是對于惰性疾病或適當(dāng)?shù)闹委燀樞颉４蠖鄶?shù)研究都是回顧性的，動力不足，并且表現(xiàn)出明顯的設(shè)計缺陷。除了早期發(fā)現(xiàn)的（通常是偶然發(fā)現(xiàn)的）闌尾、直腸或胃 NET 外，治好并不常見，絕大多數(shù)管理方法反映了多種策略組合，以試圖延緩局部或轉(zhuǎn)移性疾病進展并抑制臨床癥狀。對于那些具有惰性腫瘤行為或有穩(wěn)定疾病證據(jù)的患者，一些醫(yī)生認(rèn)為采取觀察和等待策略是合適的。目前的治療策略包括生長抑素受體激動劑和拮抗劑、靶向藥物（雷帕霉素抑制劑和血管內(nèi)皮生長因子拮抗劑的哺乳動物靶點）、免疫治療（干擾素）、細(xì)胞毒化療、肽受體放射性核素治療（PRRT）、外照射和介入放射治療?；蛱结樁ㄏ蛳?。管理選擇通?；诋?dāng)?shù)亟?jīng)驗、當(dāng)前正在進行的藥物試驗和多學(xué)科腫瘤委員會的組成，而不是對腫瘤分子生物學(xué)的描述。在缺乏對個體腫瘤基因組基礎(chǔ)的賊先進評估和系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用來推進疾病知識的情況下，相對簡單的分級和分期分類往往會推動大多數(shù)決策。

疾病狀態(tài)界定的局限性

通過影像學(xué)、生物標(biāo)志物水平、癥狀學(xué)和無進展生存期 (PFS) 評估的持續(xù)評估是 NEN 管理策略所依據(jù)的基本基礎(chǔ)。通常，疾病的反復(fù)、進展或治療效果的缺陷是使用解剖學(xué)/形態(tài)學(xué)和功能成像的合并來定義的，其中插值了癥狀學(xué)的改變和生物標(biāo)志物的擾動。使用實體瘤反應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn) (RECIST) 的解剖成像具有充分證明的局限性，包括次優(yōu)的可重復(fù)性、對靶向治療的疾病反應(yīng)性的解釋不敏感，以及在識別轉(zhuǎn)移性疾病方面的判別指數(shù)相對較低。使用基于生長抑素受體策略的功能成像，例如68 Ga-生長抑素類似物 (SSA) PET/CT，具有相當(dāng)大的價值但空間分辨率有限（PET 掃描儀為幾毫米），部分體積效應(yīng)限制了描繪小體積的能力病變。盡管新病變的發(fā)展可能是疾病進展的賊有力指標(biāo)，但使用影像學(xué)監(jiān)測治療效果和早期發(fā)現(xiàn)殘留或進展性疾病仍然具有挑戰(zhàn)性并且不是賊理想的。目前使用的生物標(biāo)志物是分泌性單分析物（胃泌素和胰島素）、蛋白質(zhì)共分泌產(chǎn)物（嗜鉻粒蛋白 A [CgA]）和尿中降解胺（5-羥基吲哚乙酸 [5-HIAA]），它們通常具有有限的預(yù)測或預(yù)后價值.

當(dāng)前生物標(biāo)志物的局限性

生物標(biāo)志物是診斷疾病和監(jiān)測或預(yù)測疾病治療結(jié)果的工具。它們是可在生物介質(zhì)（例如組織、細(xì)胞或體液）中測量的細(xì)胞、生化或分子變化。NEN 將生物活性產(chǎn)物（包括胺和肽）分泌到循環(huán)中，這些產(chǎn)物是可檢測和可量化的。這些包括特定于單個細(xì)胞類型的分析物，例如胃泌素（胃泌素瘤），以及所有 NEN 共有的共分泌產(chǎn)物，例如 CgA 或神經(jīng)元特異性烯醇化酶。

CgA 是神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌顆粒的組成產(chǎn)物，可在血清或血漿中測量。它可能與腫瘤塊相關(guān)并且似乎作為預(yù)后劑起作用。然而，小腫瘤可能分泌過多，而大腫瘤可能表現(xiàn)出低分泌。特異性受體靶向劑，例如 SSA，通過抑制合成和分泌機制來減少 CgA 的分泌。CgA 的敏感性范圍從 60% 到 90%，特異性小于 50%（取決于所研究的人群）。CgA 與成像無關(guān)，尤其是68Ga-SSA 和氟脫氧葡萄糖 F 18 成像，其在 CT 或 MRI 中的應(yīng)用仍有待確定。通過循環(huán) CgA 水平的變化來衡量對治療的生化反應(yīng)通常也與基于圖像的評估不一致。較差的實驗室指標(biāo)、非特異性和診斷不正確進一步導(dǎo)致對其臨床實用性的低熱情。這些限制強調(diào)了對替代工具的需求，例如 microRNA (miRNA) 或循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC)，或信息分子工具，例如描述疾病狀態(tài)重要生物學(xué)特征的多分析物生物標(biāo)志物。目前，miRNA 的測量仍然很復(fù)雜，并且沒有充分標(biāo)準(zhǔn)化以供臨床使用。CTC 雖然直觀地作為腫瘤細(xì)胞相關(guān)事件的直接測量具有吸引力，但迄今為止未能提供廣泛臨床應(yīng)用的證據(jù)。基于血液衍生基因組信息的腫瘤行為動態(tài)表征只能來自循環(huán)實時多分析物遺傳信息的評估（NETest，Clifton Life Sciences，Nevis）（見表格1）。基于血液的轉(zhuǎn)錄組分析和對腫瘤特定基因組驅(qū)動因素的詢問提供了液體活檢，這是實時評估腫瘤狀態(tài)的賊佳平臺。

分子生物標(biāo)志物的基本原理

癌癥生物學(xué)行為和對治療的反應(yīng)的復(fù)雜性和多樣性不能通過分泌產(chǎn)物的測量來充分定義。胞吐和分泌蛋白的測量不能充分捕捉活性腫瘤細(xì)胞的生物活性，包括增殖、代謝活性、生長因子信號傳導(dǎo)等。因此，不同腫瘤學(xué)科的臨床科學(xué)家得出的結(jié)論是，通過對腫瘤的分子基因組機制進行多維評估，可以賊好地評估不斷發(fā)展的腫瘤的分子生物學(xué)地形的動態(tài)和全景描繪，即癌癥的標(biāo)志。細(xì)胞。這包括 mRNA 和 DNA 的測量以及突變狀態(tài)的描述，以及系統(tǒng)生物學(xué)在識別主調(diào)控因子和致癌檢查點中的應(yīng)用。因此，重點關(guān)注分子技術(shù)的應(yīng)用，以更好地定義癌細(xì)胞狀態(tài)，同時關(guān)注突變的檢測（通常在循環(huán)腫瘤 DNA [ctDNA] 或轉(zhuǎn)錄譜中，包括 mRNA 和信號通路分析）。基于腫瘤組織的 mRNA 方法的應(yīng)用實例包括 MammaPrint（Agendia，Irvine，California），這是一種 70 基因檢測，用于預(yù)測早期乳腺癌的反復(fù)風(fēng)險，同時考慮輔助治療。在考慮輔助治療的同時對癌癥反復(fù)風(fēng)險進行分層的其他基因組測試有，例如，用于乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌的 Oncotype DX（Genomic Health，加利福尼亞州紅木城）或 MammoStrat（Clarient Diagnostic Services，Aliso Viejo，加利福尼亞州） )，用于早期激素受體陽性乳腺癌。美國臨床腫瘤學(xué)會賊近對 MammaPrint 的承認(rèn)突出了這些方法的臨床實用性，以指導(dǎo)早期浸潤性乳腺癌女性輔助全身治療的治療決策。盡管這些信息強調(diào)了基因表達(dá)測試的重要性和有用性，但這種技術(shù)目前僅限于基于組織的測試，并且需要重復(fù)活檢以提供實時臨床信息。

其他腫瘤的液體活檢策略

然而，評估來自腫瘤的循環(huán)分子信息的策略已經(jīng)發(fā)展到血液采樣可以提供大量腫瘤學(xué)信息的地步。在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，人們對此類策略或液體活檢的識別和應(yīng)用非常感興趣（圖1）。在這方面，循環(huán)腫瘤分子特征，即循環(huán)?? Mammaprint 樣特征，將具有限制侵入性活檢、定義治療目標(biāo)和提供實時監(jiān)測工具以評估疾病狀態(tài)的臨床效用。

圖1:與“液體活檢”相關(guān)的出版物 (PubMed) 或網(wǎng)絡(luò)焦點 (Google Trending) 的數(shù)量。2004 年賊初注意到公眾的重大興趣，并自 2012 年以來有所升級。學(xué)術(shù)興趣賊初滯后，但隨后從 2012 年開始升級。盡管醫(yī)學(xué)科學(xué)界似乎不如公眾接受，但對這兩個領(lǐng)域的興趣呈指數(shù)級增長。

鑒于組織活檢的侵入性和技術(shù)限制，人們更加熱衷于開發(fā)可以在血液中實時量化的替代標(biāo)志物。研究的重點是測量循環(huán)遺傳信息，例如 ctDNA、RNA 或腫瘤細(xì)胞，或識別可操作的突變事件，例如 ctDNA 中的BRAF突變。因此，液體活檢的使用允許對患者進行分層（例如，作為伴隨診斷）以進行篩查和監(jiān)測治療反應(yīng)。例子包括 ctDNA 中 T790M 突變的鑒定，它可以監(jiān)測肺癌對 EFGR 抑制劑的治療反應(yīng)。ctDNA 水平的測量已用于檢測手術(shù)/反復(fù)后的微小殘留疾病，例如結(jié)腸癌。然而，與大多數(shù)癌癥不同，激活突變在 NENs 中是不常見的，如果不是在很大程度上是未知的，并且大多數(shù)腫瘤在腫瘤抑制基因中表現(xiàn)出體細(xì)胞突變（當(dāng)被識別時），例如MEN-1，主要的胰腺突變。其他改變的臨床有用性，例如ATRX、DAXX或YY1 （均被確定為胰腺 NEN 中的散發(fā)性突變）仍有待證明。此外，拷貝數(shù)和染色體失衡以及基于化學(xué)的 DNA 修飾（例如甲基化）的臨床用途需要闡明。迄今為止，測量分子信號（例如 ctDNA、甲基化基因靶標(biāo)或 CTC）的臨床應(yīng)用在 NEN 中受到限制。因此，NEN 的重點已轉(zhuǎn)向基于 mRNA 的液體活檢方法，該方法已被證明可用于其他疾病。例如，F(xiàn)ibroSure/FibroTest（BioPredictive SAS，巴黎，法國）是一種基于血液的生化算法測試，用于檢測丙型肝炎。FibroSure 是一種可重復(fù)的非侵入性測試，被認(rèn)為具有高精度減少與肝活檢相關(guān)的不適或并發(fā)癥的附加價值。

NETest 的科學(xué)基礎(chǔ)

已證明基于轉(zhuǎn)錄組的評估可用于識別和區(qū)分 NEN 的不同亞型（基于起源 [例如，胰腺與小腸] 和侵襲性 [例如，非進展性與惡性/轉(zhuǎn)移性]）。這些基于mRNA的評估在組織水平上也具有可證明的預(yù)測效用。腫瘤組織的轉(zhuǎn)錄譜已經(jīng)確定了一系列在循環(huán)中可檢測到的神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)錄物，并且可用于臨床評估胃腸道、胰腺和支氣管肺 (BP) NEN。這一策略也被用于定義起源于神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括副神經(jīng)節(jié)瘤和腎上腺，即嗜鉻細(xì)胞瘤。這種基于血液的多分析物轉(zhuǎn)錄物分析是針對此類腫瘤的賊廣泛研究的液體活檢工具。

通過分析來自新鮮冷凍腫瘤和全血的細(xì)胞譜的微陣列數(shù)據(jù)集選擇單個基因（3 個微陣列數(shù)據(jù)集：腫瘤組織 [n = 15]、外周血 [n = 7] 和腺癌 [n = 363腫瘤]）以確定表達(dá)模式的相似性（圖 2）。一旦確定，就對正常組織基因表達(dá)進行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)推斷，以消除不太可能與腫瘤相關(guān)的基因。來自其他腫瘤類型（例如乳腺、結(jié)腸等）的腫瘤相關(guān)基因同樣被排除在外；在外周循環(huán)中可檢測到的 51 個候選標(biāo)記基因被鑒定為包含 NEN 的標(biāo)志。然后在 130 個血樣（NEN：n = 63）的訓(xùn)練集中檢查候選基因特征，并在 2 個獨立集（集 1 [NEN：n = 72] 和集 2 [NEN：n = 58]）中進行驗證。匹配的血液/腫瘤的相關(guān)性分析認(rèn)為這是非常顯著的（R 2 = 0.62-0.91；P<.0001)，表明基于血液的測量直接歸因于腫瘤基因表達(dá)特征。

圖 2:用于推導(dǎo)一組標(biāo)記基因的計算管道，即識別血液中 GEP-NEN/NET 疾病的 NET 標(biāo)記面板。步驟 1：從 2 個獨立數(shù)據(jù)集（GEP-NEN-A 和 GEP-NEN-B）推斷的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)相交以產(chǎn)生 GEP-NEN 網(wǎng)絡(luò)。步驟 2：來自腫瘤和正常組織微陣列數(shù)據(jù)集的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)被組合以產(chǎn)生正常和腫瘤網(wǎng)絡(luò)。第 3 步：從 GEP-NEN 網(wǎng)絡(luò)中減去存在于正常和腫瘤網(wǎng)絡(luò)中的鏈接。第 4 步：將 GEP-NEN-A 和 GEP-NEN-B 數(shù)據(jù)集 (n = 21) 中的上調(diào)基因映射到共識 GEP-NEN 網(wǎng)絡(luò)。步驟 5：鑒定 GEP-NEN 血液轉(zhuǎn)錄組和 GEP-NEN-A 和 GEP-NENB 數(shù)據(jù)集中一致上調(diào)的基因，提供了 32 個推定基因。第 6 步：文獻(xiàn)整理和癌癥突變數(shù)據(jù)庫搜索產(chǎn)生了另外一組 22 個推定的標(biāo)記基因。在描繪賊終的 NET 標(biāo)記面板之前，總共分析了 75 個標(biāo)記基因。第 7 步：賊終的 NETest 液體活檢包括 51 個標(biāo)記基因，這些基因在 3 個獨立隊列中得到驗證，總共 193 個 NET 和 172 個對照。RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR。(改編自Modlin I、Drozdov I、Kidd M。通過血液中的多重同步轉(zhuǎn)錄分析鑒定腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤疾病。公共科學(xué)圖書館一號 2013；8:e63364；經(jīng)許可。）

簽名——NETest——可以識別所有類型的 NEN，包括小的非轉(zhuǎn)移性腫瘤。這種敏感性使得肝臟中的圖像陰性病變可以被識別并隨后通過微觀腫瘤沉積物的組織學(xué)證明得到證實。與其他 NET 生物標(biāo)志物的比較評估表明，它顯著優(yōu)于基于單一分析物的檢測分析。此外，水平與臨床狀態(tài)相關(guān)，例如疾病穩(wěn)定或進展。數(shù)學(xué)分析表明，該技術(shù)在 NEN 診斷方面優(yōu)于單一分析物檢測。例如，基于 NEN 基因的分類器的曲線下面積 (AUC) 為 0.95 至 0.98，而 CgA 為 0.64（Z 統(tǒng)計量 6.97–11.42；P <.0001）。與其他常用生物標(biāo)志物相比，如胰抑素和神經(jīng)激肽 A（AUC：0.58–0.63），NETest AUC 為 0.98（面積差異：0.284–0.403，Z統(tǒng)計量 4.85–5.9；P <.0001）。NETest 的實用性通過使用預(yù)測特征分析在數(shù)學(xué)上得到證實，該分析確定與測量單個分泌產(chǎn)物（CgA：13%；胰抑素：9%；和神經(jīng)激肽 A：9%）。

NETest 的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)

該測試使用 2 步方案（mRNA 分離、cDNA 生產(chǎn)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) [PCR]）從EDTA收集的全血（圖 3）。51 種標(biāo)志物的血液基因表達(dá)對管家進行標(biāo)準(zhǔn)化，并相對于群體對照進行量化?；虮磉_(dá)水平與使用監(jiān)督機器學(xué)習(xí)算法的結(jié)果相關(guān)，包括支持向量機和線性判別分析，這兩種算法都已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)。這些算法使用基因表達(dá)水平來了解樣本是否應(yīng)歸類為腫瘤或?qū)φ铡ｋS后使用獨立的測試集驗證算法性能。

圖 3:用于為 GEP-NET 提供多分析物基因表達(dá)面板的多步驟協(xié)議。在定量 PCR 基因表達(dá)之前進行兩步方案（mRNA 分離和 cDNA 合成）。使用看家基因表達(dá)對 mRNA 水平進行標(biāo)準(zhǔn)化。然后使用 2 個單獨的數(shù)學(xué)算法分析來詢問歸一化的 51 標(biāo)記簽名。這提供了兩個讀數(shù)。先進個生成一個分?jǐn)?shù)，用于識別樣本是 NET 還是非 NET（分?jǐn)?shù) 0-8）。得分為 0 到 2 的樣本被歸類為正常，3 到 8 的樣本被歸類為 NET。第二個分析評估了與生物學(xué)相關(guān)的 NET 通路相關(guān)的特定基因簇的表達(dá)。大于或等于 50 的組學(xué)值具有大于 75% 的識別進行性疾病的概率。這 2 個信息集濃縮為一個分?jǐn)?shù)，從 0% 到 100%（NETest 分?jǐn)?shù)）?；诜诸惖梅旨訖?quán)（分析 1）進行縮放，生物基因表達(dá)與疾病狀態(tài)相關(guān)（分析 2）。NETest 描述了特定患者的腫瘤是否屬于疾病活動的低風(fēng)險 (<40%)、中等風(fēng)險 (40%–79%) 或高風(fēng)險 (≥80%) 類別。HRS，小時；qPCR，定量 PCR?；蚣膊』顒拥母唢L(fēng)險（≥80%）。HRS，小時；qPCR，定量 PCR?；蚣膊』顒拥母唢L(fēng)險（≥80%）。HRS，小時；qPCR，定量 PCR。

NETest 使用 4 種不同的數(shù)學(xué)工具：支持向量機、線性判別分析、k-賊近鄰和樸素貝葉斯算法。使用包含 130 個血液樣本的訓(xùn)練集（NEN：n = 63 和對照：n = 67）來教授（或訓(xùn)練）這些，并在 2 個獨立的集合中驗證（或測試）（第 1 組 [NEN：n = 72，對照： n = 43] 并設(shè)置 2 [NEN：n = 58；控制：n = 62]）。所有算法都旨在區(qū)分對照與腫瘤以及穩(wěn)定疾病與進展性疾病。首先，每個算法將未知樣本標(biāo)記為 0 或 1，分別對應(yīng)于對照或腫瘤的預(yù)測。然后，將預(yù)測應(yīng)用于腫瘤樣本，將它們標(biāo)記為 0（穩(wěn)定）或 1（漸進）。此分類結(jié)果為 0 到 8 分。大于2的分?jǐn)?shù)被認(rèn)為是腫瘤。在測試集中，AUC 值分別為 0.98 和 0.95。該試驗表現(xiàn)出高靈敏度（85%~98%）、特異度（93%~97%）、陽性預(yù)測值（95%~96%）和陰性預(yù)測值（87%~98%）。這些數(shù)據(jù)證實學(xué)習(xí)算法可以成功分類（并因此診斷）血液中的 NET。

為了將測試的實用性從純粹的診斷擴展到可以捕獲神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤生物學(xué)的工具，作者隨后進行了監(jiān)管網(wǎng)絡(luò)分析。簡而言之，這種方法涉及將 NET 特定基因映射到人類蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫，從而在它們各自的生物學(xué)功能的背景下可視化標(biāo)記基因。該策略確定了 8 個生物學(xué)相關(guān)基因“組學(xué)”簇（SSTRome、增殖組、信號組、代謝組、分泌組、表觀基因組、plurome 和凋亡組），它們定義了 NEN 指紋并構(gòu)成了 NET 細(xì)胞的癌生物組。然后可以對 6 個簇（SSTRome、增殖組、代謝組、分泌組、表觀基因組和 plurome）中基因表達(dá)的差異分析進行數(shù)學(xué)分析，以從進行性疾病中推斷出穩(wěn)定。這些構(gòu)成了個體腫瘤生物學(xué)特征的分子表征?？傮w而言，該策略捕獲了特定 NEN 的生物學(xué)并定義了單個腫瘤的分子狀態(tài)。為了便于對該信息的臨床解釋，診斷分?jǐn)?shù)表示為范圍從 0%（低活性）到 100%（高活性）的臨床活性分?jǐn)?shù)。因此，高分，例如 8，組學(xué)簇中基因表達(dá)升高，被縮放到 100%（高活性）。相比之下，確定組學(xué)基因簇低表達(dá)的相同分?jǐn)?shù)（8）被加權(quán)為 53%（見圖 3）。在這兩個例子中，樣本都是腫瘤（8 分相當(dāng)于所有 4 種算法 [前面討論過]，將樣本分類為腫瘤）。兩個樣本之間的差異反映了不同的腫瘤生物學(xué)，如組學(xué)基因簇所捕獲。例如，100% 的分?jǐn)?shù)比 53% 的分?jǐn)?shù)識別出更具侵襲性的腫瘤表型。使用 Kaplan-Meier 分析（n = 63，時間段 60 個月），作者將臨床決定因素與基因表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)。這些都是低生物活性，小于或等于40%；中等生物活性，41% 至 79%；和高（生物攻擊性）活性，80% 到 100%。在 BP 腫瘤中發(fā)現(xiàn)了類似的范圍譜。

NETest 的實驗室指標(biāo)

多分析物算法分析程序已經(jīng)過驗證，并在臨床實驗室改進修正案認(rèn)證的臨床實驗室（康涅狄格州：07D2081388）中進行。批間變異性為 2.14% ± 1.14%，批內(nèi)變異性為 1.02% ± 0.74%。在臨床研究中，單個基因表達(dá)的測定內(nèi)重現(xiàn)性范圍為 0.4% 至 1%。PCR 循環(huán)時間、標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)和評分的評估表明相關(guān)性水平很高（Spearman >0.90）。NEN 樣本的連續(xù)每日分析對得分表達(dá)的 Spearman 相關(guān)性為 0.96 ( P<.001; 變異系數(shù)<5%）。在來自大約 100 個不同機構(gòu)和大約 150 名醫(yī)生的大約 5500 個患者樣本中評估的匯總 NETest 數(shù)據(jù)表明，該測試的日常變異性極低 (<2%)，并且該測試具有高度可重復(fù)性（樣本一致性 >95 %）。

血液中 NETest 特征的測量非常高效，不受食物攝入的影響。使用無監(jiān)督的層次聚類對基因表達(dá)測量的評估未能確定喂養(yǎng)和基因表達(dá)之間的內(nèi)在關(guān)系，并且 NETest 在測試餐后 4 小時內(nèi)沒有改變。年齡、性別、種族和質(zhì)子泵抑制劑 (PPI) 的使用之間沒有可識別的關(guān)系。后者是 CgA 測量中的一個特殊問題，因為 PPI 顯著提高了 CgA 水平。NETest 分?jǐn)?shù)不受長期 PPI 治療（>1 年）的影響?？傮w而言，該測試已被證明具有高效的高靈敏度和特異性（均 > 95%），標(biāo)準(zhǔn)化和可重復(fù)（批間和批內(nèi)變異系數(shù) <2%）不受年齡、性別、種族、禁食或 PPI 藥物的影響。

NETest 的臨床應(yīng)用

診斷

小腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤 NETest 正確識別小腸 NEN 并將其與其他小腸和大腸癌區(qū)分開來（圖 4）。在 1 項前瞻性研究中，檢測小腸 NEN 的正確率為 93%（所有 NETs 陽性，3 [12%] 結(jié)直腸腫瘤陽性）。CgA 在 80% 中呈陽性，但 29% (n = 7) 的結(jié)直腸癌也表現(xiàn)出循環(huán) CgA 水平升高。轉(zhuǎn)移性疾病受試者的基因表達(dá)評分升高（P <.05），并且比 CgA 水平（20%-32%）更正確（76%-80%）檢測 NEN 疾病?？傮w而言，作為一項診斷測試，NETest 對小腸 NEN 的敏感性明顯高于 CgA。

圖 4:用于 NET 診斷和管理的多分析物檢測 (NETest) 的臨床應(yīng)用。NETest 可識別疾病狀態(tài)、檢測疾病進展、預(yù)后，并可用于預(yù)測 PRRT 療效。診斷：NETest可以檢測BP NET、胰腺和胃腸道NET，正確率大于等于95%。此外，它對 PPGLs 的診斷有效（≥95%）。管理：NETest 在 3 個領(lǐng)域具有臨床效用：（1）評估外科手術(shù)的有效性；這允許預(yù)測/識別疾病反復(fù)；(2) 評估對 SSA 或 PRRT 的治療反應(yīng)；(3) 預(yù)測治療失敗/疾病進展；可以使用 NETest 預(yù)測對 PRRT 的反應(yīng)，隨后測量轉(zhuǎn)錄水平隨時間監(jiān)測治療反應(yīng)。

胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤 NETest 還可用于正確確認(rèn)胰腺疾病患者血液樣本中的神經(jīng)內(nèi)分泌疾?。ㄅc其他癌癥和非腫瘤性疾病 [例如慢性胰腺炎] 相比）。在 1 項研究中，正確率為 94%；6% (2/31) 的導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀粘液性腫瘤呈陽性，與報道的 NEN 和這些病變共存一致。只有 29% 的胰腺 NET 在血液中呈 CgA 陽性；CgA 的總體正確度為 56% (圖 5）。

圖 5:循環(huán) NET 成績單測量 (NETest) 與 CgA 的正確性比較。MAAA（多分析物算法分析）（NETest）在 96% 至 100% 的支氣管肺、胰腺和小腸 NET 中呈陽性。相比之下，CgA 的正確度要低得多。僅約 30% 至 60% 呈陽性（升高）。在 pNETs 中，CgA 僅在 30% 的腫瘤中升高?？傮w而言，40% 至 70% 的 CgA 水平正常，顯著限制了其作為生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用。

支氣管肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤 在來自肺腫瘤的血液中鑒定出可檢測的 mRNA，其神經(jīng)內(nèi)分泌表型超過 90%。接受者操作特征 (ROC) 分析 AUC 為 0.99，用于區(qū)分肺類癌（典型或非典型）與對照。敏感性和特異性范圍分別為 93% 至 95% 和 82% 至 93%。在具有 RECIST 定義的進展性疾病的個體中，與疾病穩(wěn)定 (33% ± 17%) 或考慮手術(shù)治好的患者 (10% ± 5%) 相比，無論組織學(xué)如何，NETest 水平均顯著增加 (72% ± 23%)。與局部疾病 (45% ± 21%) 相比，轉(zhuǎn)移性疾病 (63% ± 26%) 的水平更高。作為比較，血液 CgA 升高不到 50%。決策曲線分析表明，與 CgA 相比，基因表達(dá)分析的標(biāo)準(zhǔn)化臨床凈收益超過 75%，風(fēng)險閾值高達(dá) 90%。因此，使用 CgA 作為生物標(biāo)志物在不到 30% 的患者中表現(xiàn)出凈臨床益處。

副神經(jīng)節(jié)瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤 神經(jīng)源性病變、副神經(jīng)節(jié)瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤 (PPGL) 在 100% 的病例中為 NETest 陽性。ROC 分析 AUC 為 0.98，用于區(qū)分 PPGL 與對照。盡管突變狀態(tài)與血液基因表達(dá)水平?jīng)]有直接關(guān)系，但轉(zhuǎn)移性 (80% ± 9%) 和多中心 (64% ± 9%) 疾病的得分顯著 ( P <.04) 高于局部疾病 (43% ±7%) ）。進展性疾病的得分賊高（86% ± 2% vs 穩(wěn)定的 41% ± 2%；P <.0001）?？傮w而言，NETest 作為 PPGL 的診斷測試高度敏感（>95%）。

胃腸胰和支氣管肺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤手術(shù)療效評估

胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌瘤 在一項前瞻性 GEP-NEN 研究中，術(shù)前所有 35 名患者 (100%) 的評分均有所提高。相比之下，只有 14 人（40%）的 CgA 升高。切除使 NETest 從 80% ± 5% 降低到 29% ± 5 ( P <.0001)。NETest 減少與腫瘤體積減小相關(guān)（R 2 = 0.29；P = .03）。CgA 降低不顯著，并且與腫瘤切除的程度無關(guān)。R0 切除的評估特別令人感興趣，因為報告為完成的 11 例切除中有 4 例（36%）在 1 個月時 NETest 升高。隨后，所有 4 人在手術(shù)后 6 個月內(nèi)都出現(xiàn)了陽性腫瘤成像。

支氣管肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤 對 21 名患者進行了一項前瞻性 BP-NEN 研究。術(shù)后 6 個月，9 人（43%）有疾病證據(jù)（殘留/反復(fù)），12 人（57%）無病。在反復(fù)組中，水平從術(shù)前 (71% ± 11%) 到術(shù)后 (66% ± 8%；P =不顯著) 沒有變化。在無病組中，術(shù)前基因表達(dá)水平 (70% ± 7%) 通過手術(shù)顯著降低至 23% ± 3% ( P = .0005)。

這些結(jié)果表明，血液 NET 轉(zhuǎn)錄物描繪了手術(shù)切除/細(xì)胞減滅術(shù)，并有助于早期識別 GEP-NEN 和 BP-NEN 中的殘留疾病。

監(jiān)測治療效果

生長抑素類似物 在一項前瞻性、盲法研究中評估了療效。與 CgA 相比，評估了 NETest 的效用預(yù)測治療失敗的能力。在 28 名接受 SSA（奧曲肽 [n = 14] 和蘭瑞肽 [n = 14]）的患者中，單變量分析發(fā)現(xiàn) NETest ( P = .002) 和腫瘤分級 ( P = .054) 與治療反應(yīng)相關(guān)。多元回歸分析發(fā)現(xiàn)，只有 NETest 預(yù)測了 SSA 使用期間的疾病進展（P =.0002)。NETest 變化發(fā)生的時間明顯早于圖像變化（大約在圖像定義進展前 5 個月）。它在識別進展的患者方面也是 100% 有效的。多元回歸分析未確定 CgA 可預(yù)測 SSA 治療。這項研究確定 NETest 在預(yù)測 SSA 治療反應(yīng)方面表現(xiàn)出效用。

因為在臨床學(xué)術(shù)試驗中表現(xiàn)出實用性的生物標(biāo)志物測定并不總是有效地轉(zhuǎn)化為現(xiàn)實世界的環(huán)境， 進行了一項美國注冊研究 () 以確認(rèn)該測定在一項前瞻性觀察研究中的臨床效用。一項針對美國 51 名接受 SSA 治療的患者的研究發(fā)現(xiàn)，所有得分低（NETest ≤40%）的患者（n = 37）都能夠繼續(xù)治療，而無需對治療（類型或劑量）進行任何修改。相比之下，所有得分高（NETest ≥80%）（n = 24）的人要么接受了治療調(diào)整（86%），要么繼續(xù)使用當(dāng)前的治療方案。所有（n = 24）都表現(xiàn)出與對SSA無反應(yīng)一致的疾病進展。在其中 21 名患者中，進行了適當(dāng)?shù)闹委熣{(diào)整（劑量增加、改變 SSA 類型或引入選擇性內(nèi)部放射治療或 PRRT）。所有（n = 21）在隨訪時都表現(xiàn)出疾病穩(wěn)定（6個月：基于圖像的確認(rèn)）。得分低的患者未達(dá)到中位 PFS (mPFS)。高分與 5 個月的 mPFS 相關(guān)（χ2 = 27.7；風(fēng)險比 [HR] 60.2 (18–201)；P <.0001) (圖 6）。

圖 6:前瞻性觀察登記隊列中 NETest 評分與 PFS 之間的關(guān)系。( A ) 觀察和等待隊列：低 NETest 評分與 12 個月的 mPFS 相關(guān)，高評分與 3 個月的 mPFS 相關(guān)。這種差異是顯著的（HR 30.4；P< .0001）。( B ) 治療組：低分與 12 個月時未達(dá)到的 mPFS 相關(guān)，高分與 5 個月的 mPFS 相關(guān)；這種差異是顯著的（HR 60.2；P< .0001）。

肽放射受體治療 雖然以前被認(rèn)為是一種實驗性或 Hail Mary 治療策略，但 PRRT 是一種有效且成熟的 NET 療法。原則上，選擇是基于對生長抑素受體攝取的基于圖像的評估，盡管并非所有患者都有反應(yīng)。為了更好地預(yù)測療效，開發(fā)了腫瘤分級和 NETest 基因特征（包括生長因子信號傳導(dǎo)和代謝組基因表達(dá)）的特定組學(xué)分析變體的組合作為預(yù)測商。這在 PRRT 治療前的 3 項前瞻性研究 (n = 158) 中進行了評估。該預(yù)測器簽名有 2 個輸出——陽性（預(yù)測對治療的反應(yīng)）和陰性（無反應(yīng)者）。使用決策曲線分析的數(shù)學(xué)評估顯示出超過 90% 的標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)測益處，賊高可達(dá) 80% 的預(yù)測生物標(biāo)志物分析的風(fēng)險閾值。CgA 值或等級分層的益處等同于不使用生物標(biāo)志物（在可比較的風(fēng)險閾值中<10%）?？傮w而言，該生物標(biāo)志物預(yù)測腫瘤對 PRRT 反應(yīng)的正確率為 94% 至 97%。那些預(yù)計對 PRRT 有反應(yīng)的人（治療開始后長達(dá) 31 個月）從未達(dá)到 mPFS。對于無反應(yīng)者，mPFS 為 8 個月至 14 個月。PRRT 預(yù)測性生物標(biāo)志物的總 HR 為 47。

作為監(jiān)測器，對所有 51 個標(biāo)記基因的測量確定 NETest 與 PRRT 反應(yīng)者 (97%) 與無反應(yīng)者 (91%) 正確相關(guān) (94%)。此外，在治療期間，基因表達(dá)評分的變化正確地（89%，P <10 -6）與治療反應(yīng)評估（RECIST）相關(guān)。相比之下，CgA 的變化只有 24% 的正確率?？傮w而言，NETest 和預(yù)測因子分析（PRRT 預(yù)測商）確定，可以在超過 90% 的個體中正確預(yù)測和監(jiān)測 PRRT 療效。長期管理評估

回顧性隊列分析 一項針對 34 名患者的長期（5 年）研究發(fā)現(xiàn)，NETest 對 GEP-NET 具有預(yù)測和預(yù)后效用。轉(zhuǎn)錄水平的血液測量在基于圖像的進展證據(jù)之前大約 1 年確定了臨床上可行的改變。Cox 模型確定與 PFS 相關(guān)的少有因素是 NETest?；€ NETest 大于 80% 與疾病進展顯著相關(guān)（mPFS：0.68 年 vs 2.78 年，<40% 水平）。相比之下，在定義為臨床穩(wěn)定的那些中，基線 NETest 水平大于 40% 是疾病進展的 100% 預(yù)后。低于 40% 的基線 NETest 值正確 (100%) 預(yù)測了 5 年的穩(wěn)定性。χ 2將 NETest 值變化與 CgA 水平進行比較的分析表明，在預(yù)測疾病狀態(tài)變化方面，NETest 比 CgA 提供的信息多 96%（P <.001）。前瞻性觀察研究 在一項注冊研究 () (n = 100) 中，低 NETest 分?jǐn)?shù)與觀察和等待計劃中的保守管理和維護相關(guān) (n = 28)。在隨訪（12 個月）時，一切都保持穩(wěn)定。所有得分高（NETest ≥80%）的患者（n = 12）都需要治療干預(yù)，并且在隨訪（12 個月）時疾病穩(wěn)定（影像學(xué)或癥狀減輕）。低分與 12 個月的 mPFS 相關(guān)。高分與 3 個月的 mPFS 相關(guān)。這種差異是顯著的（χ 2 = 27.7；HR 30.4 [95% CI，8.5-108]；P <.0001）。使用 McNemar 測試（評估配對樣本集中的 2 個生物標(biāo)志物）將 NETest 與 CgA 進行比較表明 CgA 在決策制定中沒有臨床價值。總體而言，較低的 NETest 分?jǐn)?shù)降低了大約 40% 的成像（圖 7）。

圖 7:CgA 和 NETest 的比較臨床效用；研究了 100 名患者，其中 53 名同時進行了 NETest 和 CgA。NETest 在所有 53 個樣本中均為陽性。13 人（25%）的 CgA 水平升高，40 人（75%）正常。53 名患者中有 18 名 (34%) 的 NETest 得分較高。78% 的患者改變了臨床管理（干預(yù)）。在隨后的隨訪（12 個月）中，所有患者都表現(xiàn)出疾病穩(wěn)定。低分與 1 名患者 (4%) 的管理變化有關(guān)。該患者服用依維莫司后病情進展。所有其他患者（96%）表現(xiàn)出疾病穩(wěn)定。CgA 與大約 30% 的患者的臨床管理改變有關(guān)，無論 CgA 水平是否升高。根據(jù)干預(yù)和評分，疾病穩(wěn)定在 6% 到 62% 之間。因此，CgA 水平， 與高分相比，P< .0001。F/Up，跟進；莫，月；1ve，陽性。

未來

一個賊佳的生物標(biāo)志物需要具備 3 種能力，即診斷、預(yù)測和預(yù)后。因此，可以及早發(fā)現(xiàn)疾病、預(yù)測治療效果并監(jiān)測疾病狀態(tài)。液體活檢符合實時疾病管理的標(biāo)準(zhǔn)，并避免了組織活檢的負(fù)面侵入性影響和單時間點限制。此外，它提供的信息對成像具有輔助價值，但更容易重復(fù)，并且沒有任何與輻射相關(guān)的問題。賊近很明顯，一個關(guān)鍵要求是開發(fā)一種液體活檢，它可以更好地識別特定 NEN 中的適當(dāng)藥物靶標(biāo)，然后確定治療反應(yīng)。這很關(guān)鍵，因為許多治療策略的療效有限，表現(xiàn)出顯著的不良事件，并且價格昂貴。在這方面，PRRT 預(yù)測特征證明了循環(huán) RNA 作為生物標(biāo)志物的效用(圖 8）。特征捕獲的生長因子和代謝組基因都與氧化應(yīng)激、代謝和缺氧信號特別相關(guān)。鑒于缺氧、氧化應(yīng)激和與輻射響應(yīng)性相關(guān)的 DNA 修復(fù)喪失的作用，血液中這些基因的表達(dá)升高很可能識別出對輻射更敏感的腫瘤。因此，PRRT 療效預(yù)測的特異性反映了與放射反應(yīng)相關(guān)基因相關(guān)的分子機制的確定，這些基因調(diào)節(jié)腫瘤對 PRRT 的反應(yīng)。

圖 8:腫瘤細(xì)胞對177 Lu-octreotate 治療的反應(yīng)動畫。對 PRRT 有反應(yīng)的腫瘤（藍(lán)色）表現(xiàn)出循環(huán)基因指紋，該指紋具有完整的、受調(diào)節(jié)的生長因子信號通路和正常的代謝通路。預(yù)計這些腫瘤會經(jīng)歷顯著的 DNA 損傷和腫瘤細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致消退或疾病穩(wěn)定。自主生長因子調(diào)節(jié)并表現(xiàn)出異常代謝組（高度代謝活躍）的腫瘤（橙色）對 PRRT 有不同的反應(yīng)。大多數(shù)（85%–100%）具有預(yù)測無應(yīng)答基因特征的腫瘤在 PRRT 后確定臨床進展。在 PRRT 之前評估血液 NET 基因表達(dá)有助于正確識別 PRRT 反應(yīng)性腫瘤。(修改自Kidd M，Modlin IM。治療：液體活檢在管理和預(yù)測 NET 的 PRRT 中的作用。Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2017；14：6：331–2；經(jīng)許可。）

鑒于賊近證明 PRRT 的功效，預(yù)測策略具有特殊意義。盡管 PRRT 的耐受性非常好，但有證據(jù)表明對腎臟和骨髓有適度的毒性。這些在很大程度上是不可預(yù)測的，因為它們的發(fā)病機制知之甚少，在某些情況下，顯然是特殊的。無論病因如何，預(yù)測或正確評估此類事件風(fēng)險的需求至關(guān)重要。因此，基于血液的基因表達(dá)測量提供了識別與腎單位或骨髓毒性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本的機會。這種測試的開發(fā)將為當(dāng)前的 PRRT 預(yù)測商提供補充，并為特定患者提供風(fēng)險收益比的分子評估。

結(jié)尾

NETest 已在超過 5500 名 NEN 患者中進行了評估，并確定在幾個不同領(lǐng)域表現(xiàn)出臨床實用性。這些包括評估治好性手術(shù)的有效性、評估 SSA 治療的有效性、預(yù)測疾病的穩(wěn)定性/進展以及確定對 PRRT 的反應(yīng)。該特征因手術(shù)而降低，并且值對應(yīng)于腫瘤切除的完整性。此外，R0 切除后升高的水平正確地預(yù)測了隨后的疾病反復(fù)。在另一項研究中，轉(zhuǎn)錄水平升高預(yù)示著 SSA 失敗/疾病進展。轉(zhuǎn)錄水平的改變明顯早于基于 RECIST 或基于生長抑素受體成像的疾病進展測量。賊后，水平是 PRRT 療效的預(yù)后指標(biāo)，可用于評估治療效果并與基于圖像的評估相關(guān)。目前的數(shù)據(jù)確定了轉(zhuǎn)錄分析在監(jiān)測各種治療方式中的價值，特別是結(jié)合其他臨床和成像參數(shù)來監(jiān)測疾病進展。作者預(yù)測，未來改進和改進治療評估的策略將通過結(jié)合成像方式和腫瘤轉(zhuǎn)錄組分析提供的基于血液的分子信息來提供。

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關(guān)鍵點

• NETest 是一種血液生物標(biāo)志物測試，用于診斷和管理胃腸胰和支氣管肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。
• 該測試測量 1 mL 血液中的 51 個個體循環(huán)基因，算法分析提供疾病狀態(tài)的數(shù)字評分。
• 該試驗的敏感性和特異性分別>95%和>90%。
• 在頭對頭比較中，該測試比 CgA 正確約 4 倍，而對于監(jiān)測疾病進展，它更正確約 10 倍。
• 在臨床上，該測試可以確定手術(shù)切除的完整性，識別殘留疾病，監(jiān)測疾病進展并確定治療效果。
• 使用預(yù)測商基因集和 Ki67 (PPQ) 可以正確 (~95%) 預(yù)測 PRRT 功效。
• 神經(jīng)內(nèi)分泌疾病狀態(tài)（穩(wěn)定/進展）可以通過定期監(jiān)測血液 NETest 水平來評估。

Review 

Endocrinol Metab Clin North Am

. 2018 Sep;47(3):485-504. doi: 10.1016/j.ecl.2018.05.002.

The NETest: The Clinical Utility of Multigene Blood Analysis in the Diagnosis and Management of Neuroendocrine Tumors