【佳學(xué)基因檢測(cè)】基因檢測(cè)技術(shù)有哪些？焦磷酸測(cè)序

核心原理是基于檢測(cè)DNA合成過(guò)程中釋放的焦磷酸，從而鑒別是否有特定核苷酸整合到DNA的合成鏈中而發(fā)展的測(cè)序技術(shù)，因此該測(cè)序技術(shù)亦稱焦磷酸測(cè)序技術(shù)。

測(cè)序。將熒光標(biāo)記的dNTP、聚合酶、引物加入到測(cè)序通道啟動(dòng)測(cè)序循環(huán)。DNA合成時(shí)，伴隨著堿基的加入會(huì)有焦磷酸被釋放，從而發(fā)出熒光，不同堿基用不同熒光標(biāo)記，讀取到核苷酸發(fā)出的熒光后，將3羥基末端切割，隨后加入第2個(gè)核苷酸，重復(fù)第一個(gè)核苷酸的步驟，直到模板序列全部被合成雙鏈DNA。

焦磷酸測(cè)序能夠快速的檢測(cè)甲基化的頻率，對(duì)樣品中的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。通過(guò)正確定量單個(gè)連續(xù)的CpG位點(diǎn)上的甲基化頻率，焦磷酸測(cè)序本身能檢測(cè)并定量甲基化水平上的改變。

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理之后的微珠放于帶有直徑約為44um的小孔的PTP平板上，平板上的每個(gè)小孔僅能容納一個(gè)微珠，將微珠固定在小孔里。測(cè)序反應(yīng)以微珠上的DNA位模板每次反應(yīng)加入一種dNTP，當(dāng)配對(duì)成功時(shí)，會(huì)釋放焦磷酸基團(tuán)。焦磷酸基團(tuán)會(huì)與反應(yīng)體系中的酶（ATP硫酸化學(xué)酶）反應(yīng)生成ATP，并和熒光素酶共同氧化熒光素從而發(fā)出熒光。每種dNTP產(chǎn)生的熒光顏色不同，記錄熒光信息并分析后即可得到測(cè)序結(jié)果。反應(yīng)結(jié)束后，游離的dNTP會(huì)在雙磷酸酶的作用下降解ATP，從而導(dǎo)致熒光淬滅，以便使測(cè)序反應(yīng)進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)。

科技簡(jiǎn)介

焦磷酸測(cè)序技術(shù)(Pyrosequencing)是一種新的酶聯(lián)水平聯(lián)測(cè)序技術(shù)，它適用于已知的短序列測(cè)序分析，其重復(fù)性、正確性與SangerDNA測(cè)序法相當(dāng)，但速度有很大提高。通過(guò)測(cè)定焦磷酸序列，可以同時(shí)分析大量樣品，為高效、低成本、快速、正確地檢測(cè)DNA甲基化、SNP等單個(gè)或連續(xù)多種核苷酸變異提供了理想的技術(shù)平臺(tái)。由于它能快速檢測(cè)甲基化的頻率，所以可以對(duì)樣品中的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行定性和定量分析，是甲基化檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。

科技優(yōu)勢(shì)

1.獲得定量序列結(jié)果的唯一技術(shù)。

2.極其正確。

3.功能多樣，適用范圍極廣。

4.靈活的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

技術(shù)性比較

工藝原理

用四種酶催化的焦磷酸測(cè)序技術(shù)是同一種反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其原理是：引物在DNA聚合酶(DNApolymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase).熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)4個(gè)酶的協(xié)同作用下，引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA序列的實(shí)時(shí)測(cè)定。

試驗(yàn)程序

排序的原則。

科技應(yīng)用成果展示

1、甲基化檢測(cè)。

灰白區(qū)：甲基化率；黃色區(qū)域：重硫酸鹽處理程度。

2、SNP檢測(cè)。

3、檢測(cè)點(diǎn)突變。

該技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)后可以滿足上百個(gè)核苷酸序列的測(cè)序工作，這樣該技術(shù)又可以滿足對(duì)重要微生物的鑒定與分型，特定DNA片段的突變檢測(cè)和克隆鑒定等方面的應(yīng)用。

原理

焦磷酸測(cè)序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。焦磷酸測(cè)序技術(shù)的原理是：引物與模板DNA退火后，在dna聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)的反應(yīng)體系由反應(yīng)底物、待測(cè)單鏈、測(cè)序引物和4種酶構(gòu)成。反應(yīng)底物為5’-磷酰硫酸(adenosine- 5’-phosphosulfat，APS)、熒光素(1uciferin)。反應(yīng)過(guò)程在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，反應(yīng)體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果它剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則會(huì)在DNA聚合酶的作用下，添加到測(cè)序引物的3’末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸(PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP,在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見(jiàn)光。通過(guò)微弱光檢測(cè)裝置及處理軟件可獲得一個(gè)特異的檢測(cè)峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則上述反應(yīng)不會(huì)發(fā)生，也就沒(méi)有檢測(cè)峰。反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。待上一輪反應(yīng)完成后，加入另一種dNTP，使上述反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取正確的DNA序列信息。

應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以用來(lái)研究單核苷酸多態(tài)性(single ucleotidepolymor—phism，SNP)，遺傳多態(tài)性，植物多態(tài)性分析，分子診斷細(xì)菌與病毒分型、甲基化分析、法醫(yī)鑒定及藥物基因組學(xué)等方面都有廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)不需要凝膠電泳，也不需要對(duì)DNA樣品進(jìn)行任何特殊形式的標(biāo)記和染色，具有大通量、低成本、快速、直觀的特點(diǎn)。與Sanger測(cè)序法相比，焦磷酸測(cè)序技術(shù)有其特定的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為DNA分析研究的重要手段。目前已經(jīng)有很多關(guān)于該技術(shù)在分子生物學(xué)上的應(yīng)用研究，而且隨著技術(shù)的不斷成熟和改進(jìn)，在實(shí)踐中的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。Jonasson等運(yùn)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)通過(guò)檢測(cè)病原菌16S rRNA基因，快速鑒定臨床標(biāo)本中抗生素抵抗菌;Monstein等用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)幽門螺桿菌16S rRNA基因(16S rDNA)易變的Vl和V3區(qū)序列，證明該技術(shù)可滿足對(duì)臨床病原菌標(biāo)本的快速鑒定和分型;Unnerstad等利用該技術(shù)對(duì)106株不同血清型的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行了分型，在短時(shí)間內(nèi)完成大量的樣本測(cè)序，其并行性和高效率非常顯著，如果用常規(guī)的測(cè)序技術(shù)，工作量會(huì)很大。Gharizadeh等人用此技術(shù)對(duì)67個(gè)人乳頭瘤病毒(HPV)樣品進(jìn)行了鑒定和分型，結(jié)果證明該技術(shù)也非常適于HPV等病原體的大規(guī)模鑒定、分型和突變的研究。瑞典Uppsala大學(xué)利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)建立了新的鑒定炭疽熱細(xì)菌(Bacillus anlhracis)及其致病狀態(tài)的方法，他們利用此技術(shù)分析染色體上的Ba813基因(此基因長(zhǎng)度為277bp，在染色體上為單拷貝是炭疽熱桿菌區(qū)別于其他土壤桿菌的標(biāo)志)20bp的特異序列來(lái)鑒定炭疽熱細(xì)菌.正確率達(dá)99.6 %，通過(guò)分析菌株是否含有兩個(gè)質(zhì)粒(鑒定pX0l的lef基因和pX02的cap基因)來(lái)確定炭疽熱細(xì)菌的致病狀態(tài).正確率達(dá)100‰。Edvinsson B等應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)T弓形體蟲(chóng)的三個(gè)亞型進(jìn)行區(qū)分，采用Real-Time PCR技術(shù)擴(kuò)增出目的片段，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)測(cè)定GRA6基因中兩個(gè)單核甘酸多態(tài)性確定其分型,該技術(shù)對(duì)典型蟲(chóng)株的正確率達(dá)到100%,對(duì)包括非典型性蟲(chóng)株的分型正確率也達(dá)到81%。該技術(shù)還被應(yīng)用于百日咳桿菌(Bordetella pertussis)與副百日咳桿菌(Parapertussis) 等細(xì)菌的快速鑒定及分型。

在國(guó)內(nèi)，該技術(shù)應(yīng)用受到越來(lái)越多研究者的重視。趙錦榮等，首先運(yùn)用PCR擴(kuò)增含耐藥決定區(qū)一297bp長(zhǎng)的rpoB基因片段，借用鏈親和素包被磁珠純化單鏈PCR產(chǎn)物，設(shè)計(jì)2個(gè)正向測(cè)序引物，運(yùn)用pyrosequencing技術(shù)對(duì)耐藥決定區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定.通過(guò)對(duì)一系列10倍稀釋的結(jié)核分枝桿菌H，R標(biāo)準(zhǔn)株DNA進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)所建立方法的檢測(cè)特異性.結(jié)果：PCR擴(kuò)增后，可在2 h內(nèi)得到耐藥決定區(qū)序列.所建立方法的檢測(cè)靈敏度為50 fg DNA/反應(yīng).在所分析的利福平敏感株中均未檢測(cè)到耐藥決定區(qū)突變，而在耐利福平菌株中均檢測(cè)到耐藥決定區(qū)突變.所建立的方法具有自動(dòng)化程度高和結(jié)果正確等特點(diǎn)，適用于對(duì)耐利福平結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行快速高通量檢測(cè)。

程紹輝等，從感染人sars病毒的Vero-6細(xì)胞中提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，PCR擴(kuò)增目的基因片段，采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)(Pyro- sequencing Technology，PSQ)進(jìn)行第2601、7919、9479、119838多個(gè)堿基突變位點(diǎn)測(cè)序和突變頻率分析。通過(guò)測(cè)序分析多個(gè)可能出現(xiàn)突變的位點(diǎn)，確定了該病毒為北京流行株，同時(shí)發(fā)現(xiàn)第7919位堿基發(fā)生了A/G突變。

宋家武等應(yīng)用該技術(shù)建立了高通量測(cè)定乙型肝炎病毒YMDD突變區(qū)的方法，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的YMDD突變質(zhì)粒及血清標(biāo)本的重復(fù)性及高效性檢測(cè)，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的突變檢出率及重復(fù)率均達(dá)100%，而血清標(biāo)本達(dá)98.8%。

另外，在法醫(yī)鑒定，以及SNP分析上都有應(yīng)用該技術(shù)的研究報(bào)道，并且可以起到快速，正確的效果。在動(dòng)物如豬的多態(tài)性分析研究中，Milan等利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)豬骨骼肌糖原含量增高與PRKAG3基因的一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的堿基置換相關(guān)，該基因編碼豬肌肉特異性的腺苷單磷酸激活的蛋白激酶異構(gòu)體的調(diào)節(jié)亞單位。

優(yōu)點(diǎn)

1.不需要制膠，不需要毛細(xì)管，也不需要熒光染料和同位素。

2.10分鐘內(nèi)可分析96個(gè)樣品的SNP,可滿足高通量分析的要求。

3.每個(gè)樣品孔都可進(jìn)行獨(dú)立的測(cè)序或SNP分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靈活。

4.序列分析簡(jiǎn)單，結(jié)果正確高效。

發(fā)展目前市場(chǎng)上焦磷酸測(cè)序儀的測(cè)序原理主要有四種，即使用合成法測(cè)序（Sequencing by Synthesis）的 454 和Solexa，以及使用連接法測(cè)序（Sequencing by Ligation）的SOLiD和Polonator。

以454焦磷酸測(cè)序技術(shù)為例，該技術(shù)無(wú)需文庫(kù)構(gòu)建，沒(méi)有克隆誤差，目前已應(yīng)用到土壤、海洋、廢水等環(huán)境生態(tài)學(xué)的研究中。而454焦磷酸測(cè)序與傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)相比，具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）高通量性：每一次循環(huán)反應(yīng)，可產(chǎn)生得到大于1Gb的數(shù)據(jù)，讀取10億個(gè)堿基；（2）效率高：每一次循環(huán)反應(yīng)僅需3天；（3）精讀范圍大：可精讀18bp個(gè)以上的重復(fù)序列；（4）方向多元：可進(jìn)行400bp長(zhǎng)度的末段雙向測(cè)序。通過(guò)對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行宏基因組提取，對(duì)其16S rDNA擴(kuò)增后，采用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)宏基因組樣品進(jìn)行測(cè)序分析，可以清楚的得到環(huán)境樣品的微生物信息。

 

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