【佳學(xué)基因檢測(cè)】基因檢測(cè)技術(shù)有哪些?焦磷酸測(cè)序
核心原理是基于檢測(cè)DNA合成過(guò)程中釋放的焦磷酸,從而鑒別是否有特定核苷酸整合到DNA的合成鏈中而發(fā)展的測(cè)序技術(shù),因此該測(cè)序技術(shù)亦稱焦磷酸測(cè)序技術(shù)。
測(cè)序。將熒光標(biāo)記的dNTP、聚合酶、引物加入到測(cè)序通道啟動(dòng)測(cè)序循環(huán)。DNA合成時(shí),伴隨著堿基的加入會(huì)有焦磷酸被釋放,從而發(fā)出熒光,不同堿基用不同熒光標(biāo)記,讀取到核苷酸發(fā)出的熒光后,將3羥基末端切割,隨后加入第2個(gè)核苷酸,重復(fù)第一個(gè)核苷酸的步驟,直到模板序列全部被合成雙鏈DNA。
焦磷酸測(cè)序能夠快速的檢測(cè)甲基化的頻率,對(duì)樣品中的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。通過(guò)正確定量單個(gè)連續(xù)的CpG位點(diǎn)上的甲基化頻率,焦磷酸測(cè)序本身能檢測(cè)并定量甲基化水平上的改變。
將經(jīng)過(guò)預(yù)處理之后的微珠放于帶有直徑約為44um的小孔的PTP平板上,平板上的每個(gè)小孔僅能容納一個(gè)微珠,將微珠固定在小孔里。測(cè)序反應(yīng)以微珠上的DNA位模板每次反應(yīng)加入一種dNTP,當(dāng)配對(duì)成功時(shí),會(huì)釋放焦磷酸基團(tuán)。焦磷酸基團(tuán)會(huì)與反應(yīng)體系中的酶(ATP硫酸化學(xué)酶)反應(yīng)生成ATP,并和熒光素酶共同氧化熒光素從而發(fā)出熒光。每種dNTP產(chǎn)生的熒光顏色不同,記錄熒光信息并分析后即可得到測(cè)序結(jié)果。反應(yīng)結(jié)束后,游離的dNTP會(huì)在雙磷酸酶的作用下降解ATP,從而導(dǎo)致熒光淬滅,以便使測(cè)序反應(yīng)進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)。
科技簡(jiǎn)介
焦磷酸測(cè)序技術(shù)(Pyrosequencing)是一種新的酶聯(lián)水平聯(lián)測(cè)序技術(shù),它適用于已知的短序列測(cè)序分析,其重復(fù)性、正確性與SangerDNA測(cè)序法相當(dāng),但速度有很大提高。通過(guò)測(cè)定焦磷酸序列,可以同時(shí)分析大量樣品,為高效、低成本、快速、正確地檢測(cè)DNA甲基化、SNP等單個(gè)或連續(xù)多種核苷酸變異提供了理想的技術(shù)平臺(tái)。由于它能快速檢測(cè)甲基化的頻率,所以可以對(duì)樣品中的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行定性和定量分析,是甲基化檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。
科技優(yōu)勢(shì)
1.獲得定量序列結(jié)果的唯一技術(shù)。
2.極其正確。
3.功能多樣,適用范圍極廣。
4.靈活的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。
技術(shù)性比較
工藝原理
用四種酶催化的焦磷酸測(cè)序技術(shù)是同一種反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),其原理是:引物在DNA聚合酶(DNApolymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase).熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)4個(gè)酶的協(xié)同作用下,引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái),通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度,實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA序列的實(shí)時(shí)測(cè)定。
試驗(yàn)程序
排序的原則。
科技應(yīng)用成果展示
1、甲基化檢測(cè)。
灰白區(qū):甲基化率;黃色區(qū)域:重硫酸鹽處理程度。
2、SNP檢測(cè)。
3、檢測(cè)點(diǎn)突變。
該技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)后可以滿足上百個(gè)核苷酸序列的測(cè)序工作,這樣該技術(shù)又可以滿足對(duì)重要微生物的鑒定與分型,特定DNA片段的突變檢測(cè)和克隆鑒定等方面的應(yīng)用。
原理
焦磷酸測(cè)序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。焦磷酸測(cè)序技術(shù)的原理是:引物與模板DNA退火后,在dna聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)4種酶的協(xié)同作用下,將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái),通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度,達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。
焦磷酸測(cè)序技術(shù)的反應(yīng)體系由反應(yīng)底物、待測(cè)單鏈、測(cè)序引物和4種酶構(gòu)成。反應(yīng)底物為5’-磷酰硫酸(adenosine- 5’-phosphosulfat,APS)、熒光素(1uciferin)。反應(yīng)過(guò)程在每一輪測(cè)序反應(yīng)中,反應(yīng)體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果它剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì),則會(huì)在DNA聚合酶的作用下,添加到測(cè)序引物的3’末端,同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸(PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下,生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP,在熒光素酶的催化下,生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素,同時(shí)產(chǎn)生可見(jiàn)光。通過(guò)微弱光檢測(cè)裝置及處理軟件可獲得一個(gè)特異的檢測(cè)峰,峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì),則上述反應(yīng)不會(huì)發(fā)生,也就沒(méi)有檢測(cè)峰。反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。待上一輪反應(yīng)完成后,加入另一種dNTP,使上述反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行,根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取正確的DNA序列信息。
應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以用來(lái)研究單核苷酸多態(tài)性(single ucleotidepolymor—phism,SNP),遺傳多態(tài)性,植物多態(tài)性分析,分子診斷細(xì)菌與病毒分型、甲基化分析、法醫(yī)鑒定及藥物基因組學(xué)等方面都有廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)不需要凝膠電泳,也不需要對(duì)DNA樣品進(jìn)行任何特殊形式的標(biāo)記和染色,具有大通量、低成本、快速、直觀的特點(diǎn)。與Sanger測(cè)序法相比,焦磷酸測(cè)序技術(shù)有其特定的優(yōu)勢(shì),已經(jīng)成為DNA分析研究的重要手段。目前已經(jīng)有很多關(guān)于該技術(shù)在分子生物學(xué)上的應(yīng)用研究,而且隨著技術(shù)的不斷成熟和改進(jìn),在實(shí)踐中的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。Jonasson等運(yùn)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)通過(guò)檢測(cè)病原菌16S rRNA基因,快速鑒定臨床標(biāo)本中抗生素抵抗菌;Monstein等用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)幽門螺桿菌16S rRNA基因(16S rDNA)易變的Vl和V3區(qū)序列,證明該技術(shù)可滿足對(duì)臨床病原菌標(biāo)本的快速鑒定和分型;Unnerstad等利用該技術(shù)對(duì)106株不同血清型的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行了分型,在短時(shí)間內(nèi)完成大量的樣本測(cè)序,其并行性和高效率非常顯著,如果用常規(guī)的測(cè)序技術(shù),工作量會(huì)很大。Gharizadeh等人用此技術(shù)對(duì)67個(gè)人乳頭瘤病毒(HPV)樣品進(jìn)行了鑒定和分型,結(jié)果證明該技術(shù)也非常適于HPV等病原體的大規(guī)模鑒定、分型和突變的研究。瑞典Uppsala大學(xué)利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)建立了新的鑒定炭疽熱細(xì)菌(Bacillus anlhracis)及其致病狀態(tài)的方法,他們利用此技術(shù)分析染色體上的Ba813基因(此基因長(zhǎng)度為277bp,在染色體上為單拷貝是炭疽熱桿菌區(qū)別于其他土壤桿菌的標(biāo)志)20bp的特異序列來(lái)鑒定炭疽熱細(xì)菌.正確率達(dá)99.6 %,通過(guò)分析菌株是否含有兩個(gè)質(zhì)粒(鑒定pX0l的lef基因和pX02的cap基因)來(lái)確定炭疽熱細(xì)菌的致病狀態(tài).正確率達(dá)100‰。Edvinsson B等應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)T弓形體蟲(chóng)的三個(gè)亞型進(jìn)行區(qū)分,采用Real-Time PCR技術(shù)擴(kuò)增出目的片段,在此基礎(chǔ)上運(yùn)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)測(cè)定GRA6基因中兩個(gè)單核甘酸多態(tài)性確定其分型,該技術(shù)對(duì)典型蟲(chóng)株的正確率達(dá)到100%,對(duì)包括非典型性蟲(chóng)株的分型正確率也達(dá)到81%。該技術(shù)還被應(yīng)用于百日咳桿菌(Bordetella pertussis)與副百日咳桿菌(Parapertussis) 等細(xì)菌的快速鑒定及分型。
在國(guó)內(nèi),該技術(shù)應(yīng)用受到越來(lái)越多研究者的重視。趙錦榮等,首先運(yùn)用PCR擴(kuò)增含耐藥決定區(qū)一297bp長(zhǎng)的rpoB基因片段,借用鏈親和素包被磁珠純化單鏈PCR產(chǎn)物,設(shè)計(jì)2個(gè)正向測(cè)序引物,運(yùn)用pyrosequencing技術(shù)對(duì)耐藥決定區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定.通過(guò)對(duì)一系列10倍稀釋的結(jié)核分枝桿菌H,R標(biāo)準(zhǔn)株DNA進(jìn)行分析,評(píng)價(jià)所建立方法的檢測(cè)特異性.結(jié)果:PCR擴(kuò)增后,可在2 h內(nèi)得到耐藥決定區(qū)序列.所建立方法的檢測(cè)靈敏度為50 fg DNA/反應(yīng).在所分析的利福平敏感株中均未檢測(cè)到耐藥決定區(qū)突變,而在耐利福平菌株中均檢測(cè)到耐藥決定區(qū)突變.所建立的方法具有自動(dòng)化程度高和結(jié)果正確等特點(diǎn),適用于對(duì)耐利福平結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行快速高通量檢測(cè)。
程紹輝等,從感染人sars病毒的Vero-6細(xì)胞中提取病毒RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,PCR擴(kuò)增目的基因片段,采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)(Pyro- sequencing Technology,PSQ)進(jìn)行第2601、7919、9479、119838多個(gè)堿基突變位點(diǎn)測(cè)序和突變頻率分析。通過(guò)測(cè)序分析多個(gè)可能出現(xiàn)突變的位點(diǎn),確定了該病毒為北京流行株,同時(shí)發(fā)現(xiàn)第7919位堿基發(fā)生了A/G突變。
宋家武等應(yīng)用該技術(shù)建立了高通量測(cè)定乙型肝炎病毒YMDD突變區(qū)的方法,經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的YMDD突變質(zhì)粒及血清標(biāo)本的重復(fù)性及高效性檢測(cè),質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的突變檢出率及重復(fù)率均達(dá)100%,而血清標(biāo)本達(dá)98.8%。
另外,在法醫(yī)鑒定,以及SNP分析上都有應(yīng)用該技術(shù)的研究報(bào)道,并且可以起到快速,正確的效果。在動(dòng)物如豬的多態(tài)性分析研究中,Milan等利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)豬骨骼肌糖原含量增高與PRKAG3基因的一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的堿基置換相關(guān),該基因編碼豬肌肉特異性的腺苷單磷酸激活的蛋白激酶異構(gòu)體的調(diào)節(jié)亞單位。
優(yōu)點(diǎn)
1.不需要制膠,不需要毛細(xì)管,也不需要熒光染料和同位素。
2.10分鐘內(nèi)可分析96個(gè)樣品的SNP,可滿足高通量分析的要求。
3.每個(gè)樣品孔都可進(jìn)行獨(dú)立的測(cè)序或SNP分析,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靈活。
4.序列分析簡(jiǎn)單,結(jié)果正確高效。
發(fā)展目前市場(chǎng)上焦磷酸測(cè)序儀的測(cè)序原理主要有四種,即使用合成法測(cè)序(Sequencing by Synthesis)的 454 和Solexa,以及使用連接法測(cè)序(Sequencing by Ligation)的SOLiD和Polonator。
以454焦磷酸測(cè)序技術(shù)為例,該技術(shù)無(wú)需文庫(kù)構(gòu)建,沒(méi)有克隆誤差,目前已應(yīng)用到土壤、海洋、廢水等環(huán)境生態(tài)學(xué)的研究中。而454焦磷酸測(cè)序與傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)相比,具有以下優(yōu)勢(shì):(1)高通量性:每一次循環(huán)反應(yīng),可產(chǎn)生得到大于1Gb的數(shù)據(jù),讀取10億個(gè)堿基;(2)效率高:每一次循環(huán)反應(yīng)僅需3天;(3)精讀范圍大:可精讀18bp個(gè)以上的重復(fù)序列;(4)方向多元:可進(jìn)行400bp長(zhǎng)度的末段雙向測(cè)序。通過(guò)對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行宏基因組提取,對(duì)其16S rDNA擴(kuò)增后,采用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)宏基因組樣品進(jìn)行測(cè)序分析,可以清楚的得到環(huán)境樣品的微生物信息。
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