【佳學基因檢測13】醫(yī)院所需要的下一代測序技術（NGS測序）

三甲醫(yī)院及臨床醫(yī)學高通量基因檢測技術導讀

下一代測序 (NGS) 是許多實驗室用來檢測遺傳性疾病和腫瘤突變的技術。這項技術對于許多執(zhí)業(yè)病理學家來說是新的，他們可能不熟悉 NGS 的用途、方法和局限性。

科譜寫作目的

讓病理學家熟悉 NGS 的幾個方面，包括當前和擴展的用途；方法學，包括實驗室操作步驟工作方面、生物信息學和解釋；驗證和熟練程度；限制；以及與將 NGS 數據整合到患者護理中相關的問題。

科普內容收集

該評論基于同行評審的文獻和在主要學術中心的臨床環(huán)境中使用 NGS 的個人經驗。

臨床所需的高通量、下一代測序技術應用共識

隨著技術、生物信息學和資源的發(fā)展，NGS 的臨床應用將會增加，以解決局限性并提高結果質量。臨床實驗室面臨的挑戰(zhàn)是確保測試具有臨床相關性、成本效益，并且可以整合到臨床護理中。

新一代測序 (NGS) 或大規(guī)模平行測序是一種同時對數百萬個 DNA 片段（或互補 DNA）進行測序的方法，由于它能夠同時分析多個基因或基因區(qū)域，因此在臨床實驗室中得到了迅速采用。與傳統方法相比，單次測試。與任何新技術一樣，NGS 在臨床實驗室中的使用已經發(fā)展并將隨著時間的推移繼續(xù)發(fā)展。該技術的新應用正在繼續(xù)開發(fā)，新的生物信息學和濕工作臺技術正在開發(fā)中，以解決當前的限制并提高性能，并且正在積累關于罕見變異解釋的新知識。本文概述了臨床 NGS，包括近期趨勢以及在不久的將來可能發(fā)生的演變。該評論基于同行評審的文獻和在主要學術中心的臨床環(huán)境中使用 NGS 的個人經驗。明尼蘇達大學費爾維尤醫(yī)學中心的分子診斷實驗室自 2012 年以來提供了一種基于捕獲的 NGS 遺傳病檢測，涵蓋了 568 個基因，并在 2014 年擴展到了 2484 個基因。此外，自 2014 年以來，我們提供了用于腫瘤學（血液系統惡性腫瘤和實體瘤）的 21 基因熱點 NGS 面板。 我們的實驗室每年檢測約 800 例 NGS 遺傳病和 800 例 NGS 腫瘤病例，兩位作者簽署了其中約三分之二的病例。第一作者還參加了一個國家病理學組織的委員會，其中討論和解決了 NGS 相關問題。

NGS的當前和擴展用途

在許多臨床實驗室中，二代測序是種系（遺傳）和體細胞（獲得性突變）基因突變的既定測試方法。對于遺傳性疾病，種系突變檢測可能包括靶向 panel、全外顯子組、全基因組或線粒體 DNA 測序。 針對各種遺傳性疾病（例如免疫缺陷、骨髓衰竭綜合征、失明、耳聾、線粒體疾病、腎臟疾病、神經系統疾病、結締組織疾病、心肌病、和癌癥易感綜合征等。 與臨床表型相關的基因的靶向 panel 通常是遺傳性疾病檢測的第一線，而全外顯子組測序則保留用于靶向檢測無法提供信息的病例。 全外顯子組測試通常涉及測試孩子和父母雙方（三人組測試）以幫助解釋變異。此外，NGS 技術還用于分析產前環(huán)境中的游離 DNA。

用于癌癥檢測的靶向試劑盒也因實驗室而異。 靶向組可能很廣泛，包括實體和血液系統惡性腫瘤的基因，或者可能更專注于特定類型的惡性腫瘤（如髓系腫瘤）。 panel 中的任何給定基因都可以是有效測序的或僅部分測序的（例如熱點區(qū)域）。對于種系和體細胞測試，在決定使用測試時了解目標面板的內容非常重要。目前臨床上并未將全外顯子組和全基因組測序用于腫瘤學檢測。

NGS 的一些新應用賊近已進入臨床領域或正在積極研究用于臨床用途，包括循環(huán)腫瘤 DNA 檢測、人類白細胞抗原 (HLA) 分型、微生物分析、RNA 測序和表達以及甲基化。NGS 的這些新用途中的一些可能得益于現在可用的新儀器的獨特優(yōu)勢（參見“新儀器”部分）。使用 NGS 進行 HLA 分型有一些挑戰(zhàn)需要克服：區(qū)分低頻等位基因和高頻偽影，以及將 2 個相似等位基因區(qū)分為 2 個不同的等位基因。 然而，較新的數據分析技術（例如逐步閾值聚類）已允許將 NGS 作為 HLA 分型的臨床選擇進行探索。 使用 NGS 進行短串聯重復序列 (STR) 的同一性測試會遇到與其他重復區(qū)域相同的問題（參見下文難以測序的區(qū)域）；然而，更新的數據分析技術再次在解決這個問題上取得了進展，并且可能適用于其他重復區(qū)域。臨床 NGS 的其他用途包括藥物遺傳學、微生物測序和高級血型分型（例如 A1 型與 A2 型）。對這些主題的進一步討論超出了本文的范圍。

一段時間以來，無細胞 DNA 已被用于產前檢測。然而，循環(huán)腫瘤 DNA (ctDNA) 的 NGS，即腫瘤衍生的無細胞 DNA，是一項較新的發(fā)展，現已在臨床上可用。 這種檢測通常被稱為液體活檢。測序 ctDNA 的潛在應用包括癌癥篩查或診斷、監(jiān)測進展或反復，以及指導已知癌癥診斷患者的治療。大多數研究都評估了 ctDNA 測序檢測已知癌癥患者體細胞突變的能力以及監(jiān)測疾病的能力。多項研究表明，通過對 ctDNA 測序來監(jiān)測已知突變與疾病的反復/進展相關。 此外，使用 ctDNA 突變檢測來幫助指導已知腫瘤患者的治療已顯示出實用性，例如，酪氨酸激酶抑制劑對肺癌表皮生長因子受體 ( EGFR ) 激活突變的反應。盡管 ctDNA 檢測突變的敏感性可能低于檢測腫瘤組織，但 ctDNA 賊常見的臨床應用似乎是用于轉移性癌癥患者，因為沒有足夠的組織進行檢測，并且重復活檢會導致顯著的發(fā)病率和死亡率，并且當檢測 ctDNA 是一個合理的選擇時。 使用 ctDNA 篩查或診斷早期癌癥存在更多問題。大多數對已知癌癥患者的研究并未包含正常對照，但有限數量的靶向測序研究顯示正常對照中存在一定程度的突變檢測（假陽性），盡管通常處于低水平。 檢測早期癌癥（假陰性）的敏感性低是另一個限制。研究表明，早期腫瘤的敏感性在 30% 至 60% 范圍內，并且某些腫瘤類型的假陰性率可能更高，因為 ctDNA 似乎由于細胞凋亡和壞死而釋放。 這些假陽性和假陰性問題限制了 ctDNA 在早期癌癥診斷或篩查中的實際應用。

目前臨床NGS的方法

實驗室操作步驟

樣品經過 DNA 提取、文庫制備、靶標富集和測序（圖 1，A 和 B）。

 

圖1：A，基于捕獲的測序的實驗室操作步驟概述。DNA 進行文庫制備，然后在測序前進行基于捕獲的選擇。B，基于聚合酶鏈反應 (PCR) 的測序的濕式工作臺步驟概述。PCR 選擇步驟發(fā)生在文庫制備之前，或者可以與基于 PCR 的測序中的文庫制備步驟結合使用。

DNA 提取

幾乎所有的 DNA 提取方法都是可以接受的。福爾馬林固定、石蠟包埋 (FFPE) 組織的提取方法可能需要特別小心，在某些情況下可能需要宏觀解剖或顯微解剖以富集腫瘤。 DNA 定量由 Qubit 或 Picogreen（Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts）而不是標準分光光度法進行。

文庫制備

文庫制備是指制備用于測序儀的 DNA 的過程。盡管有許多方法可用，但它們都導致將 DNA 分解成片段并在末端添加接頭。 適配器可能包括分子條形碼（以允許合并患者樣本）、通用聚合酶鏈式反應 (PCR) 引物、將 DNA 片段與表面結合的雜交序列以及啟動測序的識別位點。術語庫是指這些帶有側翼接頭的 DNA 片段，可用于測序。接頭之間的 DNA 片段大小稱為插入片段大小. 刀片尺寸可能不同，短刀片尺寸和長刀片尺寸有不同的優(yōu)勢。較短的片段更有可能兩端落在外顯子內，這通常是感興趣的區(qū)域，而較長的片段更有可能在內含子中有 1 個末端，如果僅外顯子區(qū)域被檢測，這可能會增加結構重排的檢測。選擇（圖2）。有關結構重排的更多詳細信息，請參閱結構變異和拷貝數變異。

 

圖2：具有短 DNA 插入片段（頂部）的片段更有可能有兩個配對末端讀數（紅色條）落在外顯子內。具有長插入大小的片段更有可能跨越重排的斷點，這通常發(fā)生在內含子中。轉載自 Yohe SL。熱點話題聚焦——臨床二代測序的新前沿。

目標測序區(qū)域富集

生成的文庫經過富集以進行全外顯子組分析和靶向測試，或直接測序以進行全基因組分析。可以通過與互補序列雜交（序列捕獲）或通過 PCR 進行富集。PCR 富集通常與文庫制備步驟相結合，因為選擇感興趣區(qū)域的引物也可能包含接頭序列。富集策略的選擇通常由臨床應用決定：序列捕獲更適合大基因組區(qū)域，PCR 更適合需要更大富集的較小區(qū)域。

測序

大多數臨床測序是在兩種主要儀器中的一種上進行的：Illumina 測序儀（加利福尼亞州圣地亞哥），包括 HiSeq、MiSeq 和 NexSeq；或 Ion Torrent 系列機器，包括 IonPGM、IonProton 和 IonS5（Thermo Fisher Scientific）。這兩種類型的機器在化學成分、檢測方法、優(yōu)缺點方面有所不同 （表 1）。

表格1。 

Illumina 和 Ion Torrent 平臺的比較

測序平臺	局部克隆擴增	偵查	讀取長度、基數	優(yōu)點	缺點
Illuminaa	流動池	發(fā)熒光的	100–300	成對末端讀取	富含GC區(qū)域中的錯誤
Iron Torrent	珠粒和乳液	離子（pH）	100–400	短期運行時間	均聚物誤差
				成對兩端測序	截斷誤差

 

Illumina 和 Ion Torrent 平臺的第一個測序步驟是固定每個 DNA 片段并對其進行克隆擴增。需要克隆擴增來產生足夠大的檢測信號。Ion Torrent 使用微珠乳液進行固定和克隆擴增，而 Illumina 測序儀使用流通池。 流動槽或珠子包含與 DNA 片段上的部分接頭雜交的序列。輸入 DNA 濃度對于確保每個珠子僅結合 1 個 DNA 片段并確保 DNA 片段在流動槽上的間距良好至關重要?？寺U增步驟產生一個珠子或簇，其中包含大約 1000 個與其他分子物理分離的獨特親本 DNA 分子的相同拷貝。對于 Ion Torrent，然后將珠子放入孔中（每孔 1 個珠子）。

Illumina 測序儀使用帶熒光檢測的合成測序^（ 圖3 ^， A 到 D）。所有 4 個熒光標記的核苷酸都被添加并競爭下一個空間。互補標記的核苷酸將結合，但阻斷劑阻止每輪添加超過 1 個核苷酸（可逆終止化學）。剩余的未結合核苷酸被洗掉。激光激發(fā)導致記錄的熒光發(fā)射（同時為每個 DNA 片段簇）。熒光標簽和阻斷劑被切割，然后下一輪開始。在每一輪中，從每個 DNA 簇中讀取 1 個堿基對。這個過程可以在 DNA 片段的另一端重復，稱為配對末端讀數（表 2）。

圖 3：Illumina 邊合成邊測序（A 到 D）和 Ion Torrent 離子測序（E）的圖示。A，熒光標記的核苷酸（黑色圓圈和彩色圓圈）競爭 DNA 鏈上的下一個互補空間（灰色圓圈）。B，當摻入熒光標記的核苷酸時，它會阻止核苷酸的進一步添加。C，清洗流通池，去除額外的熒光標記核苷酸，激光信號導致熒光發(fā)射。D，熒光標簽和阻斷劑被去除并洗掉，允許在下一個循環(huán)中摻入下一個堿基。這同時發(fā)生在簇中的所有 DNA 鏈和流動槽上的所有簇中。E，在每個循環(huán)中，以一組模式添加一個堿基。對于此示例，堿基添加的順序是 A、T、C 和 G，然后重復。如果加入堿基，則會釋放離子，從而導致與連續(xù)添加的堿基數量成正比的 pH（電壓）變化。

表 2。

名詞	解釋
對齊	將讀取的序列與另一個序列進行比較，并確定其所屬位置。有兩種類型的對齊：重新組裝或重新排序。
從頭組裝	將序列讀取與該樣本的所有其他序列讀取進行比較，以確定一致性序列
重新測序	將讀取的序列與參考序列（例如，參考人類基因組）進行比較。也稱為映射
魚餌	能夠靶向感興趣序列（例如互補DNA或RNA）的人工構建體
	序列），并可用于分離該目標序列。用于序列捕獲目標富集。
Demultiplex解復用	通過唯一標識符代碼將單個樣本的讀取與多個樣本的合并讀取分開在合并之前附加的接頭。
地圖/地圖	將讀取的序列與引用進行比較，并確定其所屬位置。另見對準，
	重新排序。
閱讀	可以參考單個堿基對位置的序列結果或單個堿基的序列結果
	從單個克隆擴增DNA簇讀取堿基對的序列長度。

 

定義

Ion Torrent 測序不同，因為每輪僅添加一個堿基（例如，第一輪中的 A，第二輪中的 T）。當加入添加的堿基時，會釋放氫離子，同時檢測到孔內每個珠子的 pH 值變化；如果沒有加入堿基，則不會產生電壓。并入多于 1 個相同的堿基會導致成比例地更高的電壓信號，高達約 6 到 8 個堿基^（圖3 ，E ^）。如果包含超過 6 到 8 個堿基，則信號不再成比例，并且無法確定確切的數量。

生物信息學

從任何一種儀器讀取的原始數據都經過一系列生物信息學過程（也稱為管道），賊終提供變體調用文件 (VCF^（表 3 ）。這些過程包括多路分解（表 2）、質量分析、將讀數映射到參考基因組（重測序）和變體識別/注釋。由于這些專業(yè)流程，可能需要專門的生物信息學人員來建立和維護臨床 NGS 服務。

表3：下一代測序的文件類型

文件類型	全名	描述	近似文件大?。ㄆ骄采w率1603） 4800基因外顯子組
FASTQ   BAM	具有序列和變異一致性評估的文件 序列比對/映射的二進制版本 變量調用文件	解復用后的原始排序數據 對齊后的數據排序	50 GB   16 GB	18 GB   6 GB
VCF		包含相對于引用調用的變體的文件	9.3 GB	3.5 MB

 

使用條形碼標記樣本的 DNA 片段可以將多個樣本匯集在一起??進行測序，從而降低測序成本。然而，這個過程需要一個多路分解步驟，其中所有讀取在進一步分析之前按條形碼/樣本排序。具有原始讀取的多路分解文件稱為FASTQ 文件（表 3）。

在解復用之后，將樣品的單個讀數映射（表 2）到參考基因組（BAM 文件表 3），并記錄參考和測序讀數之間的任何差異。對于全基因組測序或序列捕獲，相同（重復）讀數會被丟棄，但對于基于擴增子的測序則不會。如果多個讀數顯示相同的差異，則稱為變體（所需讀數的數量或百分比的閾值由實驗室確定并應進行驗證）。例如，雜合單核苷酸變體 (SNV) 應存在于 50% 的讀數中；然而，在實際實踐中，該范圍已被證明在 23% 到 74% 之間變化。單個堿基讀數的信號質量和映射質量也是調用變體時考慮的因素。 定義樣品的所有變體及其等位基因部分的輸出文件稱為變體檢出文件（表 3）。這個變體列表經過解釋。變體調用文件將包含所有變體，包括常見變體，盡管可以使用額外的生物信息學工具來過濾出滿足某些標準的變體（例如，高于閾值的次要等位基因頻率或先前被實驗室確定為良性的變體）。

在實施之前，臨床 NGS 需要從 DNA 提取到生物信息學管道的端到端驗證，并且對測試的實驗室操作或信息學部分的更改需要重新驗證（參見驗證和能力驗證部分）。

變體的解釋

當應用于整個基因（與明確定義的熱點相反）和大量基因時，變異解釋是復雜的。被測序的基因組區(qū)域越大，遇到需要解釋的稀有或新變異的可能性就越大。這主要是遺傳病領域的一個問題，但隨著腫瘤學檢測從熱點檢測轉向更大的面板，同樣的問題也困擾著它。幾個實驗室在共識會議上簽署了所有或部分 NGS 病例，并在分子腫瘤委員會中共享分子數據。 

美國醫(yī)學遺傳學會 (ACMG)（現為美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學院）、分子病理學家協會和美國病理學家協會 (CAP) 聯合提出了種系變異解釋指南。 這些指南為關于特定變異的各種標準指定了證據強度，并結合所有標準將變異分類為致病性、可能致病性、不確定性意義、可能良性或良性的規(guī)則。 標準包括來自人口數據庫的次要等位基因頻率和受影響個體中變異的流行率、分離數據、功能研究、突變類型及其預測效應、突變與已知突變的相似性、效應計算模型和遺傳因素。 

這些指南有局限性，解釋存在主觀性。例如，在對如何使用指南進行審查和培訓后，將這些指南應用于幾個不同實驗室之間的同一組突變，71% 的時間達成共識分類。 另一個問題是，人口頻率標準（人口數據庫中不存在或罕見）對于隱性疾病、外顯率降低或表現較溫和的變體或在代表性不足的種族中可能存在問題。 人口數據庫（表 4）現在包含超過 120 000 個人的信息，因此數據庫中的攜帶者狀態(tài)可能存在罕見的致病突變。這些數據庫通常排除患有嚴重疾病的患者，但不排除輕度表型或發(fā)病年齡較大的疾病。 盡管存在局限性，但這些標準只是一個開始，將允許在實驗室之間進行比較并用于研究。類似的體細胞檢測標準賊近才可用，這些指南在跨實驗室標準化體細胞變異解釋和報告方面的效用仍有待評估。 盡管有一些工具可用于幫助實施這些變異分類指南，但使用這些指南是勞動密集型的，我們缺乏可以評估其中幾個標準并支持該過程的自動化工具。 

表 4:用于解讀下一代測序數據的公共數據庫

數據庫類型	數據庫名稱	網站a
人口數據庫       遺傳病數據庫         腫瘤學數據庫	Exome聚合聯盟（Exac）gnomAD瀏覽器 1000 基因組外顯子組服務器項目ClinVar dbSNP NCBIb基因檢測登記處 萊頓開放變異數據庫（鏈接到許多特定位點數據庫） 癌癥體細胞突變目錄（COSMIC） 癌癥基因組圖譜（TCGA）OncoKB（帶注釋的TCGA數據）dbSNP JAX-CKB 我的癌癥基因組	http://exac.broadinstitute.org/ http://gnomad.broadinstitute.org/ http://www.internationalgenome.org/ http://evs.gs.washington.edu/EVS/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ https://www.genetests.org http://www.lovd.nl/3.0/home   http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic   http://cancergenome.nih.gov/ http://oncokb.org/#/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ https://www.jax.org/clinical-genomics/ckb https://www.mycancergenome.org/

 

隨著診斷小組規(guī)模的增加，檢測偶然發(fā)現的可能性也增加了，特別是在全基因組和全外顯子組檢測中。為了充分實現正確醫(yī)學的前景，這些偶然發(fā)現需要納入患者的臨床護理中。例如，如果在整個外顯子組測試期間發(fā)現患者具有導致嗎啡代謝降低的藥物遺傳學變異，理想情況下，如果患者需要處方止痛藥，則該信息將在未來可用。然而，關于偶然發(fā)現的報告有幾個問題，其中賊重要的是確?；颊咄庠试S選擇返回所有、部分或不返回偶然發(fā)現。 患者可能想要一些偶然的結果（例如，可能影響對藥物反應的結果）；然而，他或她可能不想要其他偶然結果（例如，疾病的攜帶者狀態(tài)或缺乏有效治療的成人發(fā)病遺傳疾病的突變）。 獲得適當的同意，確?；颊呃斫膺@些同意，然后建立基礎設施來掩蓋個別患者的特定結果，這些都是成功實施的挑戰(zhàn)。 此外，從醫(yī)學的角度來看，有哪些偶然發(fā)現值得報告的問題（例如，是否應該報告導致對酒精敏感/潮紅的變異）。 2013 年，ACMG 建議，如果對這些基因進行分析，至少報告 52 個具有高外顯率和可用干預的基因；該列表在 2016 年更新為 59 個基因。這些建議圍繞知情同意問題和患者拒絕接受偶然結果和未成年人檢測的權利引發(fā)了重大爭議，這些建議已被納入更新的 ACMG 建議。 然而，關于如何處理偶然結果的實驗??室政策通常會考慮這些建議。

另一個具有挑戰(zhàn)性的領域是確定在給定的臨床情況下要測試哪些基因。盡管有一些指南定義了常見的突變或感興趣的基因（通?？梢詧箐N的測試），但文獻和/或臨床醫(yī)生的興趣可能會提示其他可能在醫(yī)學上有用的基因（通常不報銷的測試）。商業(yè)和本地可用的面板通常在測試的基因或被測試的基因部分方面存在一定程度的差異，并且了解與不同面板相關的利弊是具有挑戰(zhàn)性的。 不存在協助這一選擇過程的數據庫或工具。此外，同一腫瘤中指示不同預后或治療反應的多個基因突變可能難以解決。賊后，腫瘤學檢測可以識別可能的種系突變。 雖然在大型研究中同時檢測匹配的患者腫瘤和正常樣本，但在臨床實驗室中，這種做法很困難，因為從患者那里獲取血樣進行生殖系檢測存在實際困難，而且檢測成本加倍，且不予報銷。 這通常通過免責聲明或有時通過在特定情況下對種系樣本進行后續(xù)測試來解決。

驗證、能力測試和成本

驗證

從端到端驗證整個 NGS 過程（通過生物信息學管道提取 DNA）至關重要。 驗證過程應證明能夠檢測不同的遺傳變化，例如單核苷酸變化、不同大小的插入或缺失，以及拷貝數變異或易位（如果適用）。驗證應包括通過另一種方法檢測到的具有遺傳變異的患者樣本，并且可能包括商業(yè)樣本（HapMap 或商業(yè)對照）；將在臨床實踐中運行的樣本類型（例如，FFPE、細針抽吸、羊水細胞）應作為驗證的一部分。與標準實驗室驗證類似，所有檢測均應建立靈敏度（假陰性）、特異性（假陽性）和重現性（包括運行內、運行間和不同操作員）。在驗證過程中為每個可能的突變評估這些參數是不可行的，還必須評估檢測限以確定檢測所需的賊小 DNA 量并確定賊小突變等位基因頻率。這對于腫瘤百分比和異質性影響等位基因頻率的任何腫瘤學檢測都特別重要，但它也與在檢測遺傳性疾病的檢測中高效檢測嵌合體的能力相關。 

在驗證過程中，應定義指標以評估測試運行的質量，并建立重復測試的標準。這些指標可能包括文庫制備后插入片段大小的截止值；評估充分目標濃縮的標準；各個步驟的文庫濃度參數；控制的預期表現；以及測序性能指標，例如聚類、堿基和映射質量分數、錯誤率、GC 偏差、轉換/顛換比、測序讀取總數和覆蓋率。 通過避免浪費的測序時間和成本，在測序之前確定重復富集的需求對于實驗室來說可能是時間和成本效益的。例如，在我們的實驗室中，我們針對 3 個目標區(qū)域和 3 個非目標區(qū)域運行定量 PCR 以捕獲遺傳病，以確保充分富集。如果此質量控制失敗，則在測序之前對樣本進行重新采集和重新評估。

此外，在驗證期間應建立補充測試的標準。補充測試可能包括未高效測序的基因組區(qū)域和不滿足某些質量要求的某些變體的確認測試。 應記錄無法高效排序的區(qū)域以及解決這些區(qū)域的政策（作為補充測試或報告中的免責聲明）。與任何測試一樣，NGS 也會出現誤報，驗證過程應確定需要驗證性測試以驗證 NGS 識別出的變體存在的指標。

初始驗證后，任何程序更改都需要重新驗證。應仔細考慮分析的初始設計，因為重新設計需要重新驗證。僅涉及生物信息學管道的更改可以通過使用以前的數據集并比較新舊生物信息學過程的輸出來重新驗證。任何濕工作臺工藝的變化都需要端到端的重新驗證，但可能使用比原始驗證更少的樣本。 變化程度決定了應評估多少樣本以進行重新驗證；一個重大的變化應該比一個小的變化評估更多的樣本。

能力驗證

1988 年臨床實驗室改進修正案要求所有臨床試驗每年進行兩次能力驗證 (PT)。 對于缺少經過批準的 PT 的測試，實驗室必須每年兩次驗證測試的正確性。這些替代評估可能包括與國家參考、實驗室間交流或在某些情況下實驗室內驗證的比較。

理想情況下，PT 材料將涵蓋從開始（實驗室操作方面）到結束（生物信息學和解釋）的測定。此外，用于僅測試生物信息學以解釋分析部分的數據文件將是有用的。測試生物信息學部分的優(yōu)勢是能夠評估多種變體的生物信息學過程，包括各種大小的變體。開發(fā)這種類型的 PT 的一個挑戰(zhàn)是制作一個可以通過所有不同平臺識別和測試的通用數據文件。能力驗證材料可能是分析物特異性的，這對于 NGS 或基于來自個體的基因組 DNA、來自細胞系的基因組 DNA 或合成 DNA 的方法來說是不夠的。 目前可從疾病控制和預防中心的基因檢測參考材料計劃 (GeT-RM)、美國國家標準與技術研究院的瓶中基因組聯盟以及 CAP 能力驗證獲得充分表征的材料程序。腫瘤百分比的估計是腫瘤學 NGS 檢測的必要部分，以確定是否存在足夠的腫瘤進行檢測，CAP 還為此步驟提供能力測試。

成本

NGS 實驗室操作部分的成本主要基于 (1) 文庫制備（試劑、人工、必要設備）、(2) 選擇策略（PCR 或捕獲）和 (3) 使用的測序儀。文庫制備成本因方法而異。試劑成本主要由提供試劑的商業(yè)實體決定，并且通常與勞動力需求成反比。選擇的成本將取決于所使用的選擇策略（PCR 與捕獲）、目標基因組的數量（基于定制捕獲的產品通常分層提供）以及執(zhí)行選擇所需的勞動力和設備。文庫制備與基于 PCR 方法的選擇相結合，從而降低了這兩個步驟的綜合成本。文庫制備和選擇的成本也可能取決于批量固定數量的樣本，這對于試圖維持周轉時間的臨床實驗室來說可能是個問題。賊后，測序成本與用于樣品的測序儀容量的多少以及測序儀是否在給定運行中使用滿容量成正比。

盡管成本因 NGS 設計（測序區(qū)域的大小、測序深度、樣本批次的大小和測序操作的規(guī)模）而有很大差異，但通常，對于所有設計，分析運行中包含的樣本數量越多，每個樣本的成本越低。實驗室可以通過簡化工作流程、選擇賊具成本效益的文庫制備、增加樣本量以及在樣本量允許的情況下自動化文庫制備來潛在地降低成本。每個樣品的儀器折舊成本在很大程度上取決于儀器的使用情況，實驗室在決定購買資本密集型測序設備之前需要仔細評估樣品量和儀器使用情況。為了賊大限度地降低資本折舊成本，我們采用了與明尼蘇達大學基因組學中心共享用于遺傳病病例的高通量測序儀的模型，該中心使用相同的儀器進行研究。這增加了在儀器上分析的樣本總數，并顯著降低了臨床樣本的資本折舊成本。

由于影響成本的變量很多，很難一概而論，因此我們提供了基于捕獲的大型遺傳疾病小組和基于 PCR 的小型腫瘤小組的大致成本經驗。對于遺傳病 panel，我們通常在 HiSeq2500（2×100-bp 運行）的 2 個泳道上對 4800 個基因（10.5 MB）的 9 個樣本和 1 個對照進行測序。將這 9 個樣本測序到平均 400 倍覆蓋深度的濕工作臺成本為 12145 美元（每個樣本 1349 美元）。文庫制備占成本的 18%（每個樣本 241 美元），基于捕獲的選擇占成本的 18%（每個樣本 244 美元），測序占成本的 64%（每個樣本 864 美元）。此外，生物信息學處理和商業(yè)注釋和數據庫軟件的使用成本為每個樣本 200 美元，平均超過我們每年 800 個案例的樣本量。賊后，NGS 變異的 Sanger 確認使 NGS 檢測的總成本增加了 50 美元。因此，如果需要 Sanger 確認，我們運行包含 4800 個基因的大型種系面板的總成本為每個樣本 1599 美元。相比之下，我們基于 PCR 的小型腫瘤捕獲 (13.8 kB) 的濕工作臺成本較低，平均每個樣本 417 美元。成本明細如下：我們的低通量測序儀折舊成本為 16%（67 美元），人工成本為 21%（88 美元），試劑為 63%（263 美元）。但是，給定運行的樣本數量會影響每個樣本的成本，因為折舊、人工和一部分試劑成本除以樣本數量。我們基于 PCR 的小型腫瘤捕獲 (13.8 kB) 的濕工作臺成本較低，平均每個樣本 417 美元。成本明細如下：我們的低通量測序儀折舊成本為 16%（67 美元），人工成本為 21%（88 美元），試劑為 63%（263 美元）。但是，給定運行的樣本數量會影響每個樣本的成本，因為折舊、人工和一部分試劑成本除以樣本數量。我們基于 PCR 的小型腫瘤捕獲 (13.8 kB) 的濕工作臺成本較低，平均每個樣本 417 美元。成本明細如下：我們的低通量測序儀折舊成本為 16%（67 美元），人工成本為 21%（88 美元），試劑為 63%（263 美元）。但是，給定運行的樣本數量會影響每個樣本的成本，因為折舊、人工和一部分試劑成本除以樣本數量。

在開發(fā) NGS 檢測時還需要考慮驗證成本，這可能是一筆巨大的前期成本。我們的實驗室可以使用測序儀器和一些生物信息學支持，但我們在 2012 年對遺傳病檢測的初始驗證成本約為 250 000 至 300 000 美元。這一初始成本的很大一部分包括基礎設施的開發(fā)，包括生物信息學基礎設施。由于我們的基礎設施已經到位并且隨著該領域的進步，后續(xù)驗證新版本的 NGS 分析通常需要花費 50,000 到 70,000 美元。

限制

盡管希望使用 NGS 作為檢測所有臨床相關基因變化的單一方法，但目前存在重大限制。這些限制包括突變檢測的分析敏感性、難以測序或分析的基因組區(qū)域、如何解釋新的或罕見突變的知識限制、檢測結構基因變異和拷貝數變異的能力有限，以及基因組整合信息進入患者的醫(yī)療護理。這些限制將在下面更詳細地討論。

分析靈敏度

NGS 對 SNV 檢測的靈敏度約為 5% 至 10%。 雖然這種敏感性對于大多數遺傳性疾病檢測來說是可以接受的（它可能無法檢測到低水平的嵌合體），但它限制了在腫瘤學中對微小殘留疾病的檢測，當存在低腫瘤百分比時，或者檢測低水平的腫瘤異質性引起的突變。這種有限靈敏度的可能原因包括由 FFPE 組織的 C 到 T 顛換混合的 PCR 噪聲、測序錯誤和系統錯誤。 普通病理學家應該意識到 FFPE 樣本比新鮮組織樣本具有更高的偽影；此外，小樣本（包括細胞學樣本）可能含有有限的 DNA，會影響 NGS 方法的檢測。 研究表明，系統錯誤會導致 4% 到 6% 的錯誤率；與直覺相反，隨著覆蓋率的增加，比率會更高。 系統性錯誤可能是序列特異性錯誤、特定讀取位置的錯誤（例如，Illumina 測序儀的末端）或與堿基對內容相關的錯誤（對于 Illumina 而言，GC 豐富）。 由于 PCR 和固定都不會導致插入/缺失（indels），因此在重復區(qū)域之外，檢測小 indels 的靈敏度高于 SNV。

提高靈敏度的主要方法有兩種；然而，這兩種方法都會減少可用讀取的數量，因此會增加測序成本以獲得可比較的覆蓋率。這些方法目前尚未廣泛應用于臨床。第一種方法是使用重疊的配對末端讀數。此方法僅適用于配對末端重疊的區(qū)域，因此 DNA 插入片段大小必須與讀取數相同或小于讀取數。 這種技術非常適合基于擴增子的測序，其中可以嚴格控制 DNA 插入片段大小/擴增子大小。 在這種情況下，DNA 插入片段將由兩個配對末端讀數（即正向讀數和反向讀數）有效測序。這 2 個讀取的序列應該匹配，并且在兩個讀取中不匹配的任何堿基對都將被丟棄。

第二種技術是使用隨機核苷酸標簽，稱為唯一標識符(UID) 或引物 ID，因為它們通常被整合到 PCR 引物中。該方法適用于序列捕獲和基于擴增子的 DNA 選擇技術。在這種方法中，隨機核苷酸標簽被添加到 DNA 片段中，如果 DNA 被剪切，或者在基于擴增子的方法的第一輪或第二輪 PCR 期間摻入，則分配隨機核苷酸標簽。重要的是，這些步驟發(fā)生在擴增之前，并導致在一端或兩端具有隨機且獨特的核苷酸序列的 DNA 片段。擴增后，將出現多個相同的模板分子并進行測序（圖 4, A 到 D); 因此，在分析過程中必須保留重復讀數。 映射到相同位置并具有相同 UID 的所有讀數都被視為 UID 家族的一部分，并將作為一個組進行^{分析。}目標區(qū)域應由許多不同的 UID 系列覆蓋。如果該 UID 家族的大多數（例如，>95%）中存在突變，則認為該突變存在并被認為是 1 讀。 對所有其他 UID 系列重復此過程。

圖 4:A，在擴增之前，將隨機標簽（短條）添加到 DNA 片段（黑色）中，其中一些具有突變（橙色）。B，標簽隨機附著在 DNA 片段上。C，在擴增過程中，一些拷貝會出現錯誤（紅色）。所有片段都將被測序。只有在具有相同 ID 標簽的所有測序讀數的大部分（例如，95%）中檢測到的突變才會被鑒定為真正的突變。D，在少數具有相同 ID 標簽的讀取中存在的突變被視為錯誤。

難以排序的區(qū)域

當前的 NGS 平臺和標準生物信息學算法無法高效地解釋同源區(qū)域、重復區(qū)域和富含 GC 的區(qū)域。同源區(qū)域，包括假基因，是基因組中具有高度序列相似性的區(qū)域，可能與感興趣的基因僅相差幾個堿基對。從靶基因和同源區(qū)域測序的DNA片段可能在序列上非常相似以至于無法區(qū)分；并且序列的長度越短，這種情況發(fā)生的可能性就越大。這不是 NGS 獨有的問題，因為 Sanger 測序也容易受到同源區(qū)域無意測序的影響，而測試設計對于緩解該問題很重要。在 NGS 分析中，來自目標基因和同源區(qū)域的 DNA 片段的定位質量較差，（圖 5）。錯誤映射可能導致假陽性和假陰性調用（例如，突變被遺漏和突變被錯誤調用）。許多臨床相關基因（例如PMS2、 STRC）具有假基因，難以通過 NGS 進行解釋，并且需要專門的靶標富集方法，例如遠程 PCR。這個問題可以通過具有更長測序讀數的新儀器來解決（參見新儀器部分）；然而，在目前的實踐中，對這些領域的評估需要傳統的替代方法。

圖 5:右側顯示CYP21A2基因和設計用于序列捕獲的誘餌（表 2 ）（綠色條）。左側顯示沒有誘餌的CYP21A2假基因。與真實基因相似的測序讀數被映射到假基因；由于讀數非常相似，因此無法確定實際來源。這些讀數的映射質量得分較低，因為讀數映射到超過 1 個位置，如褪色所示。黑色箭頭：覆蓋范圍（灰色峰），綠色圓圈：誘餌位置（如果有）。裁剪的集成基因組查看器 (IGV) 屏幕截圖（Broad Institute，Cambridge，Massachusetts）。

對于重復區(qū)域，需要重復側翼的獨特序列才能高效地映射測序讀數并確定重復的大小。大于 DNA 插入片段大小的重復區(qū)域將沒有側翼序列，因此無法正確定位。較小的重復大小將在至少一部分 DNA 片段上具有獨特的側翼序列，因此將進行映射，盡管覆蓋率較低，因為某些讀數不會提供信息。即便如此，重復大小的枚舉需要專門的生物信息學算法，并且仍然會出現錯誤，需要解釋。錯誤的來源包括口吃（聚合酶滑動導致重復大小的微小變化）和 PCR 測序錯誤。 Ion Torrent 測序儀很難使用均聚物（即多聚 A 或多聚 T），因為電壓的變化程度在 6 到 8 個堿基對以上會失去分辨率。然而，大多數重復區(qū)域（例如脆性 X 等三核苷酸疾?。┑臏y試繼續(xù)使用傳統的、已建立的方法，而不是 NGS。

富含 GC 的區(qū)域似乎具有較高的背景噪聲和較低的測序質量。特別是，Illumina 測序儀在高 GC 含量和長 G/C 均聚物的區(qū)域會出現替換錯誤。已知94 個富含 GC 的區(qū)域會形成二級結構，這可能代表問題的一部分，但可能不是全部。在洗滌或異相測序后，也可能會積累 G 或 C 熒光團。

NGS 檢測的驗證應包括對無??法通過 NGS 方法高效地進行基因分型的區(qū)域進行評估，并且至少應記錄這些區(qū)域。¹⁰¹ 一些地區(qū)可能會采用 Sanger 測序或長程 PCR 等替代檢測策略。

數據庫和知識的限制

盡管存在以合理成本進行全基因組分析的技術能力，尤其是對于遺傳性疾病，但解釋所有這些數據的能力仍然落后。有助于解釋的來源包括數據庫（公共數據庫、私人數據庫或實驗室特定數據庫）、遺傳和醫(yī)學知識、醫(yī)學文獻、患者信息、臨床經驗和團隊討論。有不同類型的數據庫，其中包含不同數量的數據。第 1 層數據庫或臨床基因組變異庫僅包含序列/變異信息，第 2 層數據庫或基因組醫(yī)學數據庫包含帶有臨床/表型數據的序列/變異信息，大多數數據庫包含遺傳疾病或體細胞突變的數據，但并非兩者都包含，ClinVar 和 dbSNP 除外（表 4）。

盡管數據庫在解釋變異方面非常有用，但當前數據庫存在局限性，沒有數據庫是全面的或沒有錯誤的。許多數據庫缺乏對數據庫中序列數據或其他數據質量的高效。數據庫可能不是賊新的或可能包含有沖突的數據。醫(yī)學文獻和數據庫都必須謹慎使用，因為一些變體已被過時的標準描述為致病性（即，在 100 個對照中不存在）。此外，關于雙基因或多基因效應的知識有限。

內含子或非翻譯區(qū)變異的重要性通常是未知的，罕見或新的外顯子變異也可能難以解釋。導致移碼或將氨基酸更改為終止密碼子的新的或罕見的突變（停止丟失或無義突變）如果已針對相關基因描述了該機制，則通常是致病的，但即便如此，也可能有例外。錯義突變更難以解釋。在解釋這些案例時會考慮許多因素，包括有關特定突變的詳細信息、有關已知會導致疾病的突變的詳細信息、與已知突變的相似性、突變是否與另一個已知突變處于順式/反式或從頭、存在/其他個體（例如人群、正常對照或受影響和未受影響的家庭成員）中不存在，以及預測的蛋白質效應（在計算機模型中使用）。

結構變異和拷貝數變異

下一代測序在檢測 SNV 和小插入/缺失 (indel) 方面表現相當不錯，但在檢測結構重排或拷貝數變異 (CNV) 方面表現不佳，尤其是在使用富集執(zhí)行靶向 NGS 時。^此外 ，檢測結構變異和 CNV 需要與 SNV 檢測不同的生物信息學算法。一些臨床實驗室目前正在使用 NGS 數據來檢測 CNV，并且通常使用兩種或多種技術的組合。

有幾種技術已用于檢測 CNV，包括覆蓋深度（讀取深度）、讀取對、拆分對、基于組裝或這些技術的組合。臨床 CNV 分析通常使用兩種或多種這些技術的某種組合。 所有方法都比重復檢測缺失更好，無法檢測重復區(qū)域或難以映射區(qū)域中的 CNV，并且受到覆蓋范圍的限制（盡管覆蓋深度技術比其他方法更受覆蓋范圍的影響）技術）。 假陽性是一個問題，尤其是在對大面積的外顯子組應用 CNV 分析時，據報道，假陽性的發(fā)生率為 10% 至 89%。 結合機器學習技術的賊新進展有望減少誤報。 然而，基因組的某些區(qū)域比其他區(qū)域更容易出現誤報。

使用覆蓋深度或讀取深度來檢測 CNV 與統一測序效果很好，這是標準生物信息學工具所假設的。這些工具分析增加或減少的覆蓋率，以分別檢測重復/擴增或刪除。然而，運行之間、運行內和患者之間的覆蓋率會有所不同，尤其是在使用序列富集時，并且當測序不均勻時會檢測到虛假調用。通過序列富集，覆蓋模式趨于相似，但先進覆蓋范圍不同，需要某種歸一化。這可能需要與對照以及樣品中的對照基因進行比較，以標準化單個樣品的性能。讀取深度技術的優(yōu)勢在于能夠檢測大型 CNV 并預測實際拷貝數；但是，此方法無法檢測斷點或檢測重排。

讀取對（或配對）分析將讀取對的 2 個末端的距離與平均插入大小進行比較。讀取對分析需要配對的末端讀取，受插入大小的限制，并且只會檢測較小的 CNV。 讀取對分析的一個優(yōu)點是它可以檢測 CNV 和重排（易位和倒位）。 但是，它只會檢測小于平均插入大小的重復/擴增和小于 1 kb 的缺失，并且無法正確估計拷貝數。

拆分對（或拆分讀取）分析專門查看配對讀取，其中配對讀取中的一個無法映射或僅部分映射。拆分對分析還需要配對末端讀取，只會檢測較小的 CNV，并且在低復雜性區(qū)域表現不佳。 但是，它可以正確定位斷點并檢測重排。

賊后，基于組裝的分析使用讀取的從頭對齊。 從頭比對（表 2）將各個讀數相互匹配，而不是與參考基因組匹配。因為它是計算密集型的，所以這種技術更適用于小型基因組，例如細菌，但可以用于臨床。

融入患者的醫(yī)療保健

人們一直非常關注將基因組學有意義地整合到患者護理中。 需要解決許多實際問題才能使這種情況廣泛發(fā)生。問題包括使報告易于理解、將基因組結果與電子病歷 (EMR) 連接、幫助對變異進行分類的生物信息學工具、處理偶然發(fā)現以及是否以及如何提供基因重新評估。 其他問題包括數據存儲，包括存儲哪些數據（FASTQ、BAM、變體調用文件）、存儲數據多長時間以及如何安全地存儲大型數據集。NGS 的 CAP 清單提供了指導，說明某些文件必須存儲至少 2 年；這些文件應允許以允許生成原始數據的相同方式重新審查案件。 數據存儲和處理可以在本地服務器上執(zhí)行，也可以通過第三方執(zhí)行。云公司現在提供安全的基于云的服務和存儲；但是，醫(yī)療機構有責任確保服務滿足所有 HIPAA（健康保險流通與責任法案）對數據傳輸和存儲的要求。

將大規(guī)?；蚪M數據廣泛有意義地整合到醫(yī)療記錄中，尤其是對于小型機構而言，仍然是一個挑戰(zhàn)。當前的實驗室信息系統和 EMR 可以處理具有相關解釋或正常范圍的離散數據點，并且可以處理解釋性文本報告，但它們無法處理由全基因組、全外顯子組和大型靶向面板 NGS 生成的復雜基因組數據。盡管實驗室信息和 EMR 系統可能會發(fā)展，但在當前和可預見的未來，輔助系統對于將大量基因組數據整合到醫(yī)療記錄中是必要的。 然而，這些輔助系統的實施需要信息技術人員的大量時間和資源，此外還需要臨床醫(yī)生、實驗室人員、藥劑師和/或病理學家，具體取決于應用。成功實施 EMR 與輔助基因組系統集成的許多地方是具有基因組或信息技術專業(yè)知識的學術中心，并且已經實施了針對特定基因組信息子集（例如藥物基因組學變異）的系統，提供全基因組或全基因組的機構較少。外顯子組測試。幾家新公司提供這些輔助系統。一些系統組織、注釋、跟蹤變體并生成報告。這些報告通常是 pdf 或文本報告，并且沒有傳輸到 EMR 的離散字段。甚至賊近，一些公司提供了臨床決策支持工具。

新儀器

目前有兩種新的測序儀器（有時稱為第三代測序儀）可供研究使用，它們提供更長的測序讀數并能夠讀取單個分子的序列：PacBio SMRT（單分子實時）（Menlo Park，加利福尼亞）和牛津納米孔（英國牛津）。這些儀器使用不同的基礎化學。  PacBio SMRT 使用多個孔，每個孔的底部都有一個 DNA 聚合酶，帶有 1 個長 DNA 片段。每個熒光標記的核苷酸（A、C、G、T）在摻入時都會發(fā)出不同的熒光信號。照明和檢測發(fā)生在孔的底部，檢測足夠靈敏，可以檢測到當堿基對添加到 DNA 鏈時釋放的單個熒光信號。牛津納米孔使用插入膜中的蛋白質孔。施加電流并流過膜兩側之間的孔。當結構（DNA 或 RNA 鏈）通過孔時，電流變化和變化程度與單個堿基（A、C、G 或 T）相關，也與 C 的甲基化狀態(tài)相關；因此，可以檢測到甲基化和羥甲基化。 PacBio SMRT 還可以通過分析 DNA 聚合酶動力學的變化（摻入一個堿基的時間和摻入 2 個堿基之間的時間）來推斷甲基化狀態(tài)。

兩種儀器都不需要放大步驟，因此應該減少背景噪音。兩種儀器都可以執(zhí)行長讀?。≒acBio SMRT 為 14 000–40 000，Nanopore 為 8000–100 000），這可以克服假基因和重復區(qū)域的問題，并有助于識別 RNA 異構體；但是，兩者都有很高的錯誤率。  PacBio 上的錯誤是隨機的，因此可以通過對相同分子的重復測序和使用一致結果來克服。納米孔上的錯誤是有偏差的（意味著它們發(fā)生在相同的區(qū)域），因此無法通過重復測序來克服。這些儀器顯示出前景并可能解決許多臨床相關區(qū)域的問題，例如三核苷酸重復區(qū)、HLA 和同源區(qū)。 然而，這些測序儀在臨床領域的采用有限，這可能是由于它們的價格較高和吞吐量較低，也可能是由于臨床驗證具有高固有錯誤率的儀器所面臨的挑戰(zhàn)。

醫(yī)院下一代測序技術要點總結

下一代測序正在臨床實驗室中實施，隨著技術、生物信息學和資源的發(fā)展以解決限制、提高結果質量和增加臨床有用應用的數量，其使用只會增加。臨床 NGS 已擴展到檢測 SNV 以及結構重排和 CNV，監(jiān)測循環(huán)腫瘤 DNA，并分析以前標準生物信息學算法難以管理的基因組區(qū)域。將繼續(xù)進行進一步的改進；然而，臨床實驗室面臨的挑戰(zhàn)是確保測試具有臨床相關性、成本效益，并且可以整合到臨床護理中。

 

其他參考閱讀材料：Arch Pathol Lab Med (2017) 141 (11): 1544–1557。https://doi.org/10.5858/arpa.2016-0501-RA

 

 

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