【腫瘤基因檢測(cè)】腫瘤患者靜脈血靶向藥物基因檢測(cè)正確性高嗎？

靶向藥物基因檢測(cè)導(dǎo)讀：

腫瘤靶向藥物技術(shù)研究收集兩組晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)患者的外周血樣本,提取cfDNA進(jìn)行Axen檢測(cè)板靶向測(cè)序,并與組織活檢結(jié)果進(jìn)行比較,旨在評(píng)估ctDNA檢測(cè)與組織活檢的一致性。結(jié)果顯示,對(duì)EGFR、KRAS等常見突變,兩種檢測(cè)高度一致;而對(duì)某些少見突變的檢測(cè),ctDNA與組織活檢的一致性較低。該流程標(biāo)準(zhǔn)化了ctDNA提取、靶向測(cè)序和生物信息學(xué)分析,以保證檢測(cè)結(jié)果的正確性。結(jié)果表明,ctDNA能正確檢測(cè)多數(shù)常見驅(qū)動(dòng)突變,但對(duì)部分少見突變檢測(cè)仍需優(yōu)化。該流程為ctDNA檢測(cè)技術(shù)向臨床轉(zhuǎn)化提供了Protocol,有助于推動(dòng)基于ctDNA的無創(chuàng)檢測(cè)在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)正確醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
 

患者入組

入組標(biāo)準(zhǔn)為腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)合作醫(yī)院醫(yī)院確診的20歲以上非小細(xì)胞肺癌患者。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的樣本收集,將患者分為兩個(gè)隊(duì)列(A隊(duì)列和B隊(duì)列)。A隊(duì)列包括新診斷的晚期或反復(fù)性非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)患者,在進(jìn)行一線系統(tǒng)化療前取樣作為baseline。B隊(duì)列包括正在進(jìn)行分子靶向治療或免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的晚期或反復(fù)性非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)患者,這些患者之前治療取得腫瘤縮小但后來進(jìn)展。排除標(biāo)準(zhǔn)為過去三年內(nèi)有其他腫瘤病史的患者,或存在小細(xì)胞癌成分的患者。

本研究遵循赫爾辛基宣言(2013年修訂版),經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者簽署知情同意書。

血樣收集及cfDNA提取

所有入組患者在每次臨床隨診時(shí)進(jìn)行常規(guī)血液采樣,同時(shí)在知情同意下額外采集研究用血樣。A隊(duì)列患者在開始治療時(shí)、第二周期化療前和確診疾病進(jìn)展時(shí)各采集三份血樣。B隊(duì)列患者在入組后按照治療反應(yīng)評(píng)估時(shí)間表定期采血,疾病進(jìn)展時(shí)采集最后一份血樣。考慮到時(shí)間和費(fèi)用限制,本研究僅分析了A隊(duì)列baseline時(shí)的樣本及B隊(duì)列疾病進(jìn)展時(shí)的樣本。

每位患者采集約10ml全血,使用Roche細(xì)胞游離DNA收集管,4°C下1000g離心10分鐘。收集上清5ml用于提取cfDNA,使用QIAamp Circulating Nucleic Acid試劑盒提取cfDNA,-70°C至-80°C保存。用Qubit dsDNA HS試劑盒和2100生物分析儀檢測(cè)提取cfDNA的濃度和總量。

腫瘤組織基因分型和靶向測(cè)序

初診時(shí)所有患者的FFPE腫瘤組織樣本進(jìn)行驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)以指導(dǎo)臨床用藥。EGFR外顯子19缺失和外顯子21 L858R突變通過PANA Mutyper試劑盒檢測(cè)。ALK融合通過VENTANA ALK (D5F3) IHC和(或)FISH斷裂信號(hào)檢測(cè)。PD-L1表達(dá)通過免疫組化檢測(cè),使用抗體包括22C3 pharmDx、Ventana SP263。

靶向測(cè)序的腫瘤組織DNA從FFPE切片中提取,使用QIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒提取,電泳和Qubit法對(duì)提取DNA進(jìn)行質(zhì)量控制。

靶向測(cè)序和變異檢出分析

ctDNA和腫瘤組織DNA均使用Axen Cancer Panel 2進(jìn)行靶向測(cè)序,覆蓋171個(gè)基因和25個(gè)融合基因重排,測(cè)序深度約為4000X。reads比對(duì)參考基因組hg19,使用GATK4.1.2和MuTect2從align過的reads中檢出體細(xì)胞變異。使用ANNOVAR數(shù)據(jù)庫對(duì)變異進(jìn)行注釋,篩選標(biāo)準(zhǔn)包括:gnomAD和NARD數(shù)據(jù)庫報(bào)告頻率小于1%的外顯子變異、預(yù)測(cè)為有害的變異、在ClinVar數(shù)據(jù)庫中無良性記錄的變異等。進(jìn)一步濾除not達(dá)到MuTect2似然比閾值及base quality要求的變異。對(duì)組織樣本設(shè)置測(cè)序depth>200,VAF>5%的過濾條件;對(duì)ctDNA樣本,由于低豐度的變異,設(shè)depth>50,變異reads數(shù)>10為閾值。統(tǒng)計(jì)變異總數(shù)計(jì)算TMB。使用COSMIC數(shù)據(jù)庫識(shí)別與肺癌相關(guān)的變異。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用R 4.1版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用秩和檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)分析臨床特征差異。使用皮爾遜相關(guān)系數(shù)評(píng)估變量相關(guān)性。OS定義為A隊(duì)列從入組起至死亡時(shí)間,B隊(duì)列從疾病進(jìn)展起至死亡時(shí)間。應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。計(jì)算ctDNA相對(duì)組織檢測(cè)的敏感性和正確度。

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