【佳學(xué)基因檢測(cè)】PKD1基因檢測(cè)與多囊腎遺傳性分析

PKD1的基因解碼

根據(jù)《人體疾病發(fā)生的基因原因分析》， PKD1是人體內(nèi)的一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白。除了PKD1以外，該基因還有其他的符號(hào)代碼， 它們是PBP, PC1, Pc-1, TRPP1。基因解碼明確負(fù)責(zé)將PKD1的基因信息傳遞給細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)生成部門的是一個(gè)由14,148堿基組成的信使核酸。它們以46 個(gè)外顯子的形式存在。這一信息是由存在于人體基因組中的長(zhǎng)達(dá)52000個(gè)堿基對(duì)提供的。基因解碼還發(fā)現(xiàn)，PKD1的時(shí)空調(diào)節(jié)序列成分中的啟動(dòng)子區(qū)域沒(méi)有在其他蛋白合成中普遍存在的TATA序列，但是具有 E2F、EGRF、ETS、MZF1的結(jié)合位點(diǎn) 、SP1 和 ZBP89。 PKD1 啟動(dòng)子還包含一個(gè) E 盒、MINI（肌肉啟動(dòng)子序列）結(jié)構(gòu)域和一個(gè) AP2 結(jié)合位點(diǎn)?；蚪獯a過(guò)程中所采用小鼠 Pkd1 啟動(dòng)子的刪除研究還明確了一個(gè)能夠驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的由280個(gè)核苷酸序列組成的時(shí)空調(diào)節(jié)片段，這一片段是時(shí)空調(diào)節(jié)和組織特異性調(diào)節(jié)的核心序列，因?yàn)轭~外的基因解碼證據(jù)表明，如果將研究的片段擴(kuò)大到更大的區(qū)域，則驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的活性會(huì)降低。在驗(yàn)證基因解碼結(jié)果的過(guò)程中，采用分子剪刀技術(shù)，突變 280 bp 片段內(nèi)的潛在 E2f 結(jié)合位點(diǎn)會(huì)降低活性指標(biāo)的強(qiáng)度，表明 E2F 在調(diào)節(jié) PKD1 基因的細(xì)胞周期依賴性表達(dá)中的作用。 這些基因解碼結(jié)果賦予了與佳學(xué)基因?qū)KD1的基因解碼、基因檢測(cè)能力超過(guò)了PKD1的蛋白編碼序列之外。

PKD1的基因突位點(diǎn)

根據(jù)突變位點(diǎn)人工智能大數(shù)據(jù)模型分析：導(dǎo)致疾病的突變已在該基因的全長(zhǎng)區(qū)域發(fā)現(xiàn)，如圖所示：
 

PKD1的致病性突變及可能致病的基因突變位點(diǎn)分布

PKD1的致病性分析

在基因解碼過(guò)程中， 基因信息破解與驗(yàn)證機(jī)構(gòu)首先在人的基因組中確定了一個(gè)可以產(chǎn)生由14000個(gè)堿基組成的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞核酸序列的基因片段，該基因信息傳遞核酸序列在一個(gè)一型多囊腎疾病患者的體內(nèi)被被染色體易位破壞。 經(jīng)過(guò)進(jìn)一步疾病表征和基因序列變化的關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)這個(gè)多囊腎患者還患有結(jié)節(jié)性硬化癥 (TSC2; 191092)。致病原因可以歸結(jié)到患者體內(nèi)的基因組序列的同一坐標(biāo)區(qū)域。 佳學(xué)基因的致病基因鑒定分析表明，該患者的母親的染色體存在一種稱之為平衡易位46,XX t(16;22)(p13.3;q11.21)的染色體突變。由于婚前孕基因檢測(cè)的重要性未被認(rèn)識(shí)到，這一致病性突變被傳遞給了她的女兒，形成了本案例中的致病基因。由于同樣的原因，該對(duì)夫妻的兒子存在45,XY 核型不平衡，具有 16pter-p13.3 和 22pter-q11.21 的單體性。使得該家庭的男性后代具有結(jié)節(jié)性硬化癥的臨床表型，這是因?yàn)槲挥?6p13.3內(nèi)的TSC2基因座在不平衡核型中被刪除。 平衡易位母女均具有一型多囊型腎病（PKD1）的臨床特征，而母親的父母也就是患者的姥爺、姥姥染色體基因檢測(cè)結(jié)果常，無(wú)結(jié)節(jié)性硬化癥臨床特征，超聲檢查無(wú)腎囊腫。 平衡易位中斷點(diǎn)的位置靠近 TSC2 基因座超過(guò) 20 kb。 基因解碼分離出一個(gè)跨越斷點(diǎn)的基因并將其命名為 PBP（“多囊斷點(diǎn)”）。 然后確定了其他I型多囊型腎?。≒KD1）患者的 PBP 基因的突變情況。 發(fā)現(xiàn)的先進(jìn)個(gè)突變是 PBP 基因 3-引物末端內(nèi)的 5.5-kb 基因組缺失，該缺失突變存在于另一個(gè)患者及其父親體內(nèi)。檢測(cè)到的第二個(gè)重排是 PBP 基因內(nèi)的 2 kb 基因組缺失，發(fā)現(xiàn)其具有 446 bp 的移碼缺失（在堿基對(duì) 1746 和 2192 之間）。 這是一個(gè)新發(fā)突變。 對(duì)第三名患者的基因組 DNA 測(cè)序表明，在 135-bp 外顯子 (601313.0001) 之后的剪接供體位點(diǎn)的 +1 位置發(fā)生了 G 到 C 的轉(zhuǎn)變。 剪接缺陷導(dǎo)致 PBP 轉(zhuǎn)錄本（堿基對(duì) 3696 至 3831）中 135-bp 的框內(nèi)缺失。 第 4 名患者的 TSC2 基因和 PKD1 基因均發(fā)生缺失。 進(jìn)一步的研究表明，缺失延展了大約 100 kb，并且缺失的大部分（如果不是全部的話）是PKD1 基因。佳學(xué)基因采用“動(dòng)物園印跡”技術(shù)，證明 PKD1 基因在哺乳動(dòng)物物種廣泛存在，且序列保守，證明其結(jié)構(gòu)與功能對(duì)所有哺乳動(dòng)物的重要性。檢測(cè)的哺乳動(dòng)物包括馬、狗、豬和嚙齒動(dòng)物。關(guān)于PKD1基因突變?nèi)绾螌?dǎo)致病疾病的發(fā)生，在基因解碼的致病性機(jī)理中存在三種用以說(shuō)明常染色體顯性遺傳的機(jī)理， 這包括單倍劑量不足、功能獲得性突變（包括顯性負(fù)效應(yīng)）和二次命中機(jī)制（需要第二次體細(xì)胞突變） 產(chǎn)生有缺陷的細(xì)胞。

基因解碼還發(fā)現(xiàn) PKD1 基因座周圍的區(qū)域異常富含 CpG 二核苷酸。 為了尋找多囊腎病的突變基因，基因解碼在位于 PKD1 基因座側(cè)翼且相距小于 750 kb 的 2 個(gè)標(biāo)記之間的區(qū)域中的 CpG 島中發(fā)現(xiàn)富含多囊性腎病的致病基因突變。在這一區(qū)域中，存在的一個(gè)基因ATP6C (108745) 是從 HeLa 和培養(yǎng)的囊性腎上皮細(xì)胞 cDNA 文庫(kù)中分離出來(lái)的。 它編碼由 155 個(gè)氨基酸組成的具有 4 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的肽。 在所有測(cè)試的組織中都發(fā)現(xiàn)了指導(dǎo)這一蛋白質(zhì)多肽生成的基因信息傳遞核酸序列mRNA，但在大腦和腎臟中賊為豐富。該氨基酸序列有與液泡 H(+)-ATP 酶的部分質(zhì)子通道有 93% 的相似性。 由于突變質(zhì)子通道在囊腫病發(fā)病機(jī)制中的可能作用，基因解碼對(duì)受影響個(gè)體的兩個(gè)等位基因?qū)?yīng)的 cDNA 進(jìn)行了測(cè)序，但發(fā)現(xiàn)氨基酸序列沒(méi)有差異。 此外，轉(zhuǎn)錄物大小和豐度在囊性腎中沒(méi)有改變。因此，基因解碼將進(jìn)一步尋找該序列與多囊腎疾病發(fā)生有關(guān)與無(wú)關(guān)的證據(jù)。

佳學(xué)基因分析多囊腎患者的致病基因突變的過(guò)程中，對(duì)該基因 3 個(gè)主要部分的 3 個(gè)區(qū)域的分析揭示了由機(jī)制發(fā)生的 2 個(gè)突變。 兩者都是同一個(gè)75-bp 內(nèi)含子中發(fā)生的缺失（18 或 20 bp），盡管這些缺失沒(méi)有破壞內(nèi)含子邊界的剪接供體或受體位點(diǎn)，但它們?nèi)匀划a(chǎn)生了基因信息傳轉(zhuǎn)錄本的異常剪接。 每種情況都產(chǎn)生了兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)合成指導(dǎo)信息鏈； 一個(gè)具有正常刪除的內(nèi)含子，而另一個(gè)由于5‘端隱含剪接體的存在，包含了應(yīng)當(dāng)刪除的 66 bp 的序列。 缺失突變基因不能指導(dǎo)產(chǎn)生正常的功能蛋白質(zhì)，從而為基因解碼的結(jié)果解釋提供證據(jù)。刪除使內(nèi)含子太小而無(wú)法使用真實(shí)的剪接位點(diǎn)進(jìn)行剪接體組裝?；蚪獯a還在內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了一個(gè) 9-bp 的直接重復(fù)序列，這可能通過(guò)促進(jìn)序列錯(cuò)位來(lái)促進(jìn)內(nèi)含子缺失。

ADPKD 的特征是在腎臟以外的各種器官（包括肝臟和胰腺）中逐漸形成囊腫。 基因解碼使用ADPKD 供體肝囊腫的 DNA發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)體細(xì)胞突變（移碼、無(wú)義密碼子、嚴(yán)重剪接突變和雜合性缺失）在肝囊腫中很常見。 所有的致病突變都被證明改變了該基因以前的正?？截?。 這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了基因解碼提出的關(guān)于囊腫(cystogenesis)雙重打擊模型，這也可以說(shuō)明疾病中的第二病灶產(chǎn)生的原因。

PKD1 基因的獨(dú)特結(jié)構(gòu)特征是其易變性的原因。 PKD1 基因的內(nèi)含子 21 中有一個(gè)極其不尋常的 2.5-kb 多嘧啶束，它會(huì)導(dǎo)致基因的突變率增加。多嘧啶束可能在其轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)中導(dǎo)致持續(xù)錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致高頻率的體細(xì)胞突變。 因此，從單個(gè)腎臟病變的水平來(lái)看，PKD1 是一種隱性疾病。

PKD1基因檢測(cè)篩查多囊性突變

PKD1 基因的突變篩選基因檢測(cè)比較困難的原因在于，所需要檢測(cè)的區(qū)域超過(guò)14000個(gè)核苷酸，而且在同一染色體上，編碼蛋白質(zhì)超過(guò)75%的區(qū)域反復(fù)出現(xiàn)。重復(fù)區(qū)域之間的序列相似性使得突變位點(diǎn)的定位和明確變得非常困驗(yàn)?；蚪獯a首先在 PKD1 的獨(dú)特 3-prime 區(qū)域中識(shí)別出突變。佳學(xué)基因開發(fā)的錨定 RT-PCR 方法使用位于單拷貝區(qū)域內(nèi)的 1 個(gè)引物和重復(fù)區(qū)域內(nèi)的 1 個(gè)引物來(lái)擴(kuò)增 PKD1 的特定重復(fù)區(qū)域，解決了很多檢測(cè)機(jī)構(gòu)所面臨的技術(shù)困難。

試圖對(duì) PKD1 基因進(jìn)行完整突變分析的面臨的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是存在幾個(gè)同源位點(diǎn)，這些位點(diǎn)也位于 16 號(hào)染色體上。因?yàn)?PKD1 及其同系物的序列在 5-prime 區(qū)域幾乎相同，大多數(shù)傳統(tǒng)的突變分析方法無(wú)法區(qū)分 PKD1 中少有出現(xiàn)的序列變異。盡管連鎖信息表明 PKD1 中的突變約占所有常染色體顯性 PKD 的 85%。但是自從PKD1基因被證明是多囊性腎病1型的致病基因以來(lái)，數(shù)據(jù)庫(kù)記載的致病基因突變?nèi)匀惠^少，并且大多數(shù)都聚集在該基因的獨(dú)特部分。該基因長(zhǎng)度的大約 70% 存在于 16p13.1 的至少 3 個(gè)忠實(shí)拷貝中。 重復(fù)區(qū)域從外顯子 1 延伸到內(nèi)含子 34，包括所有插入序列。 PKD1 拷貝被轉(zhuǎn)錄，但它們各自的 mRNA 分子可以根據(jù)大小與真實(shí)的 PKD1 轉(zhuǎn)錄物區(qū)分開來(lái)。 此外，平分 PKD1 的內(nèi)含子 21 是一個(gè)不尋常的約 2.5 kb 的多嘧啶片段。 該元素也存在于 PKD1 同系物中。

為了通過(guò)基因檢測(cè)檢查分析 PKD1 的重復(fù)區(qū)域，佳學(xué)基因設(shè)計(jì)了一種新策略，該策略依賴于遠(yuǎn)程 PCR 和來(lái)自基因獨(dú)特區(qū)域的單個(gè)基因特異性引物，以擴(kuò)增跨越外顯子 23 到 34 的 PKD1 特異性模板。這個(gè) 10-kb 模板，從 基因組 DNA，可用于使用范圍廣泛的基于序列的方法進(jìn)行突變分析。 Watnick 等人使用這種遠(yuǎn)程 PCR 策略通過(guò)異源雙鏈分析篩選序列變異。 (1997) 確定了幾個(gè)在外顯子 23 和 25 中具有堿基對(duì)替換簇的受影響個(gè)體。在 2 名患者中，這些在外顯子 23 中確定的變化預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)短鏈中的多個(gè)氨基酸替換。 這種不尋常的堿基對(duì)替換聚類表明突變可能是由 PKD1 基因的獨(dú)特結(jié)構(gòu)特征引起的。 腎囊腫是由體細(xì)胞突變引起的觀察結(jié)果以及遺傳性多囊腎病中由此暗示的高頻率“二次打擊”也表明了一種不尋常的突變機(jī)制。 瓦特尼克等人。 (1997) 觀察到 PKD1 基因在 1、21 和 22 內(nèi)含子中有 3 個(gè)長(zhǎng)的多嘧啶片段，其中賊長(zhǎng)的是 2.5 kb 在內(nèi)含子 21 中。內(nèi)含子 21 中的片段是當(dāng)時(shí)測(cè)序的賊長(zhǎng)多嘧啶片段，包含 23 主干長(zhǎng)度至少為 10 個(gè)核苷酸的鏡像重復(fù)。 他們預(yù)測(cè)，在適當(dāng)?shù)臈l件下，鏡像重復(fù)很可能形成由三螺旋構(gòu)象組成的 H-DNA 結(jié)構(gòu)。 三螺旋結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞的局部誘變。 簇狀多堿基對(duì)替換的不尋常模式與與三螺旋形成相關(guān)的模式一致。

多囊性腎病的致病基因鑒定基因解碼的檢測(cè)范圍及檢出率

在采用以全外顯測(cè)測(cè)序?yàn)闄z測(cè)范圍、以基因解碼分析技術(shù)為基因突變注釋的雙盲臨床實(shí)驗(yàn)中，收納了174172 名患者（中位年齡，60 歲；60.6% 為女性），303 名患者經(jīng)過(guò)臨床診斷指標(biāo)確診為ADPKD，其中 235 名患者有明確的診斷依據(jù)記錄。 除 PKD1 和 PKD2 外，IFT140、GANAB 和 HNF1B 中的功能喪失突變(LOF)在多重比較校正后被確定與ADPKD 診斷相關(guān)，而這些基因在很多基因檢測(cè)包和基于數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的基因檢測(cè)中未被納入。 在 PKD1 有功能喪失突變（LOF)變異的患者中，68 名患者中有 66 名 (97%) 患有 ADPKD； 在 PKD2 中具有功能喪失突變（LOF)的 43 名患者中有 43 名 (100%) 患有 ADPKD。 揭示出這一類突變的高發(fā)病率及高穿率。相比之下，之前被數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)定為“可能致病”的 PKD1 錯(cuò)義變異的 77 名患者中只有 24 名 (31.2%) 患有 ADPKD，基因解碼認(rèn)變這可能是分類錯(cuò)誤、也可能是這些突變引起的致病性可以受其他基因或者是外界環(huán)境的影響。在通過(guò)臨床表征審核組審定的ADPKD 診斷患者中，235 名患者中有 180 名 (76.6%) 通過(guò)致病基因鑒定基因解碼找到了潛在的遺傳原因，其中大多數(shù)是在 PKD1（127 名患者）或 PKD2（34 名患者）上存在基因突變，這也是為什么對(duì)于價(jià)格敏感患者，佳學(xué)基因推薦進(jìn)行這兩個(gè)基因的全檢測(cè)的原因。235 人中有 19 人 (8.1%) 在與囊性腎病相關(guān)的其他基因中存在變異，因此如果檢則是為了追求高檢出率，應(yīng)當(dāng)遵循佳學(xué)基因遺傳咨詢師的推薦。在這 235 名確診的 ADPKD 患者中，150 名 (63.8%) 有 ADPKD 家族史。 與沒(méi)有家族史的患者相比，具有 ADPKD 家族史的患者的 ADPKD 的找到致病基因的比率更高（91.3% [137/150] 對(duì) 50.6% [43/85]；差異，40.7% [95% CI， 29.2%-52.3%]；P < .001）。在這一雙盲對(duì)照實(shí)驗(yàn)中， 在其他基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)中未檢出的 PKD1、PKD2 和 GANAB 基因突變，結(jié)過(guò)基因解碼技術(shù)進(jìn)行鑒定，證實(shí)了致病性。